Секвенирование днк по максаму-гилберту

Определение "Секвенирование днк по максаму-гилберту" в ЭБНБ

Этот метод также называется секвенированием ДНК методом химической деградации по Максаму-Гилерту.
За 20 с лишним лет, прошедших с момента разработки метода определения нуклеотидной последовательности ДНК с помощью ограниченной химической модификации азотистых оснований, происходящей под действием различных реагентов и дальнейшего расщепления цепи ДНК по местам таких модифицированных оснований, заметно изменились многие составляющие всего этого процесса. Так, для получения фрагментов ДНК, несущих метку на одном из своих концов и пригодных для их последующего секвенирования, стали использовать несколько иные подходы, включая и ПЦР. Расширился выбор меченых молекул, повысилась разрешающая способность электрофоретического разделения, "упростилась" радиоавтография, усовершенствовался этап "чтения" нуклеотидной последовательности с радиоавтографа геля. Значительный прогресс достигнут в области компьютеризации секвенирования ДНК. Однако центральный элемент метода секвенирования ДНК по Максаму-Гилберту - химическая деградация меченой цепи ДНК - изменился за эти годы не так сильно. Хотя многими исследователями и предлагались различные варианты модификаций тех или иных азотистых оснований, все же в основном арсенале этого метода находятся 4-6 химических реакций, показывающих наиболее стабильные результаты. К числу важных результатов, полученных с помощью данного метода, следует отнести нуклеотидную последовательность плазмидного вектора pBR322 [Sutcliffe, 1978], впоследствии несколько уточненную.

Несмотря на относительно низкую производительность метода секвенирования ДНК путем химической деградации по Максаму-Гилберту в сравнении с ферментативным методом секвенирования ДНК по Сэнгеру, этот метод в настоящее время все же продолжает использоваться и в отдельных случаях почти незаменим. Так, метод химической деградации применяется для секвенирования синтетических олигонуклеотидов в тех случаях, когда это необходимо. Особо "трудные" участки с сильной вторичной структурой не всегда бывает возможно секвенировать с помощью ферментативного построения новой цепи ДНК и тогда используют данный метод. Кроме этого, с помощью секвенирующего гель-электрофореза возможно выявление ДНК/белковых взаимодействий после того, как исследуемая ДНК в комплексе с белком была подвергнута химической модификации по Максаму-Гилберту. К некоторому преимуществу метода секвенирования ДНК химической деградацией можно отнести то, что здесь определяется последовательность фрагмента ДНК, или геномного, или клонированного, в каком-либо подходящем векторе (т.е. реплицировавшегося in vivo), а не новосинтезированная in vitro копия, как в ферментативном методе с дидезокситерминаторами. Еще одно отличие метода секвенирования ДНК по Максаму-Гилберту от метода Сэнгера заключается в том, что его осуществление может начаться практически с любого сайта узнавания какой-нибудь рестрикционной эндонуклеазы, присутствующего во вставке и поэтому не требуется предварительного знания даже небольшого участка нуклеотидной последовательности, окружающего данное место. В этой связи метод секвенирования ДНК путем химической деградации иногда выступает в качестве стартового при выполнении крупномасштабных проектов по определению нуклеотидных последовательностей протяженных фрагментов ДНК. В то же время нельзя не отметить серьезный недостаток метода секвенирования ДНК по Максаму-Гилберту, заключающийся в высокой токсичности большинства используемых реагентов, обращение с которыми и их дальнейшая утилизация требуют соблюдения определенных правил.

• Принцип секвенирования ДНК по Максаму-Гилберту
• Мечение фрагментов ДНК по Максаму-Гилберту
• Подготовка фрагментов ДНК по Максаму-Гилберту
• Расщепление ДНК по модифицированным основаниям
• Электрофорез и радиоавтография по Максаму-Гилберту