Расщепление днк по модифицированным основаниям

Определение "Расщепление днк по модифицированным основаниям" в ЭБНБ

Секвенирующая реакция по гуаниновым остаткам

Модификация части азотистых оснований подготовленного меченого фрагмента ДНК является первым этапом при проведении реакций химической деградации. В оригинальной работе Максама и Гилберта [Maxam, Gilbert, 1977] для модификации пуринов была проведена предварительная стадия ограниченного метилирования остатков гуанина с помощью диметилсульфата. Затем инкубация этой частично метилированной ДНК в фосфатном буфере при рН 7,0 и последующий разрыв сахарофосфатной цепи с помощью гидроокиси натрия привели к расщеплению, имеющим характер G > А. Аналогичная процедура отщепления оснований, но с использованием вместо фосфатного буфера соляной кислоты, и дальнейший разрыв цепи дали реакцию А > G. Была также показана принципиальная возможность осуществления расщепления ДНК только по гуанинам, заключающаяся в дальнейшей обработке частично метилированной с помощью диметилсульфата ДНК пиперидином. Эта реакция была названа альтернативной и не вошла тогда в основной арсенал методов секвенирования ДНК путем химической деградации. Однако впоследствии эта реакция модификации гуанинов стала обязательной ввиду ее относительной простоты и воспроизводимости. Еще одна альтернативная реакция А > С, где модификация оснований проводилась с помощью гидроокиси натрия с последующим разрывом сахарофосфатной цепи пиперидиновым гидролизом, оказалась менее удобной и в дальнейшем использовалась не так широко. Реакцию модификации пиримидинов С + Т проводили с помощью гидразина и последующего гидролиза пиперидином. С целью модификации только цитозиновых остатков использовали раствор гидразина вместе с NaCl.

В дальнейшем этими авторами была опубликована большая статья с подробным изложением не только этапов модификации и гидролиза азотистых оснований, но и с многочисленными протоколами проведения различных реакций подготовительного характера [Maxam, Gilbert, 1980; русский перевод данной статьи Максам, Гилберт, 1986]. Приведенные в этой статье прописи реакций модификации G, G + А, С + Т и С оказались весьма удобными как при их проведении, так и при чтении радиоавтографа геля. Однако, пожалуй, единственная реакция модификации G с помощью диметилсульфата в последующие годы практически не подверглась сколь-нибудь серьезным изменениям и использовалась многими исследователями при секвенировании ДНК (рис.).

Реакция G + А существует в двух вариантах, общим для которых является кислотный гидролиз. В первом варианте, предложенном Максамом и Гилбертом [Maxam, Gilbert, 1980], для осуществления кислотного гидролиза использовался формиат пиперидиния, представляющий собой 4%-ную муравьиную кислоту, доведенную пиперидином до рН 2,0.

Главным недостатком этого подхода (кроме значительной продолжительности протекания реакции) является необходимость трудоемкого и длительного этапа лиофилизации для удаления пиперидина. Кислотный гидролиз с помощью 66%-ной муравьиной кислоты, предложенный Скрябиным и соавт. [Скрябин и др., 1978], обеспечивает сравнимую специфичность расщепления ДНК по пуриновым основаниям (G + А) и не требует этапа лиофилизации.

Что касается пиримидинов, были предложены различные реагенты для их модификации. Некоторые из этих реакций не нашли широкого применения ввиду или нестрогой специфичности, или высокой сложности. К наиболее широко применяемым можно отнести классические реакции с использованием гидразина [Maxam, Gilbert, 1980], а также перекиси водорода [Свердлов, Калинина, 1983; Richterich et al., 1995], солянокислого гидроксиламина, перман-ганата калия или гидразин ацетата [Rubin, Schmid, 1980; McCarthy, 1989]. Однако эффективность модификации одно- или двуцепочечной ДНК некоторыми из этих реагентов весьма различается, что необходимо учитывать при выборе условий проведения реакций.

Ввиду скоротечности большинства реакций модификации азотистых оснований особая забота проявлялась по их одномоментной остановке с тем, чтобы произошла модификация лишь ограниченной части оснований. Для этой цели в классических реакциях (G - диметилсульфат; С + Т - гидразин; С - гидразин + 1М NaCl) использовались специальные стоп-буферы, не позволяющие реакциям пройти слишком далеко и произвести модификацию излишнего количества оснований. Следующим этапом при проведении упомянутых реакций являлась стадия осаждения препаратов ДНК этанолом. Полнота осаждения достигалась выдерживанием при температуре -70°С или даже при температуре жидкого азота. Затем следовало переосаждение ДНК и многократные промывки этанолом для удаления примеси солей. Весьма трудоемкой была процедура удаления пиперидина после этапа β-элиминации с помощью лиофилизации. Все это отнимало много времени, поэтому были предложены способы одновременной остановки реакций и осаждения препаратов ДНК бутанолом [Bencini et al., 1984] или ацетоном [Барам, Грачев; 1985; Данилюк и др., 1986]. В первой работе, кроме осаждения бутанолом, применялось также трехдорожечное секвенирование ДНК в виде реакций А > С (гидроокись натрия, 90°С), Т + С (гидразин), G + А (муравьиная кислота). Сопоставление полос на трех соседних дорожках все же позволяло "читать" последовательность ДНК. К сомнительному преимуществу такого подхода можно отнести экономию числа дорожек. В дальнейшем способ осаждения бутанолом был с успехом применен и для остальных классических реакций G - диметилсульфат; С -гидразин +1М NaCl [Chirala, Wakil, 1986]. Однако при использовании бутанола имел место эффект не столько осаждения ДНК, а скорее полного удаления воды и в связи с этим с осадком ДНК могли оставаться следовые количества солей, которые необходимо было тщательно удалить перед этапом гидролиза пиперидином во избежание неспецифического расщепления.

Применение для остановки течения реакций и осаждения препаратов ДНК ацетона с использованием в качестве соли имеющего высокую растворимость в органических растворителях перхлората лития в значительной степени решало эту проблему. Более того, ацетон количественно и практически мгновенно осаждал не только длинные фрагменты ДНК, но и короткие олигонуклеотиды. Этот вариант быстрого секвенирования, разработанный Данилюком и соавт. [Данилюк и др., 1986], позволял в короткий срок и с минимальными усилиями получать препараты ДНК, пригодные для нанесения на секвенирующий гель. Замена нерастворимого в ацетоне NaCl на LiCl и LiOH, обладающих лучшей растворимостью, в реакции модификации цитозиновых остатков позволила повысить специфичность расщепления и уменьшила фон, возникающий после пиперидинового гидролиза ввиду обычно неполного удаления NaCl.

Разработанные способы твердофазного секвенирования ДНК методом химической деградации также позволяли избежать большинства длительных и трудоемких процедур и значительно сократить время на приготовление препаратов ДНК, пригодных к нанесению на секвенирующий гель. Было показано, что специфичность реакций химической модификации и последующего гидролиза пиперидином меченых препаратов ДНК в растворе и иммобилизованных на DEAE-бумаге одинакова [Чувпило, Кравченко, 1983]. Относительными недостатками этого подхода были непрочность самого носителя - DEAE-бумаги и чувствительные потери препаратов ДНК в реакции модификации цитозина из-за присутствия солей на стадии пиперидинового гидролиза и при элюции образцов. Новый носитель для твердофазного секвенирования ДНК, CCS-бумага с анионообменными свойствами, обладающая высокой механической прочностью, позволила проводить одновременные реакции ограниченной модификации азотистых оснований на одной полоске бумаги различных образцов ДНК и, таким образом, даже автоматизировать процесс секвенирования [Rosenthal et al., 1985]. Важным свойством этого носителя является также относительно незначительная потеря образцов ДНК во время проведения реакций ограниченной модификации, а также осуществляемые в одну стадию пиперидиновый гидролиз и элюция ДНК. Данная CCS-бумага под торговым названием М & G Hybond в течение ряда лет поставляется фирмой "Amersham International pic" и пользуется заслуженной популярностью.

Были предложены и другие подходы, заменяющие этапы центрифугирования при проведении реакций химической модификации оснований в методе Максама-Гилберта [Jagadeeswaran, Kaul, 1986; Boland et al., 1994]. Так, в первой из этих работ использовалась обращенно-фазовая хроматография с носителем С18, что обеспечило быстрое удаление химических реагентов после завершения первого этапа модификации оснований. Далее элюированные с помощью ацетонитрила модифицированные препараты ДНК высушивали и подвергали стандартному гидролизу пиперидином, однако его удаление представляло уже определенную проблему из-за плохого связывания ДНК с носителем C₁₈ в присутствии пиперидина (даже разбавленного в 10 раз после завершения реакции). Добавление в реакционную смесь 1М уксусной кислоты перед этапом хроматографии позволило разрешить эту проблему, и после элюции очищенные от следов пиперидина препараты ДНК разделялись секвенирующим гель-электрофорезом. Таким образом, при осуществлении данного подхода вместо этапов центрифугирования и лиофилизации использовалась колоночная хроматография. В другой своей работе эта же группа авторов [Boland et al., 1994] заметно усовершенствовала данный подход, заменив, в первую очередь, носитель C₁₈, часто необратимо сорбирующий обработанные пиперидином препараты ДНК, на стеклянный порошок, лучше подходящий для проведения секвенирования методом химической деградации. Более того, оказалось возможным проводить все химические реакции этого метода секвенирования с препаратами ДНК, сорбированными на стеклянном порошке с завершающей элюцией уже готовой для электрофоретического разделения ДНК с помощью высокой концентрации NaJ. Это позволило авторам с помощью лабораторного робота Biomek 1000 (Beckman, США) автоматизировать трудоемкий процесс проведения химических реакций при секвенировании ДНК по методу Максама-Гилберта.

Относительно недавно был предложен новый вариант твердофазного секвенирования ДНК с использованием магнитных частиц, покрытых стрептавидином [Ohara R., Ohara О., 1995]. Фрагменты ДНК, меченные биотином по 5' -концу с помощью ПЦР, сорбировались на данные магнитные частицы и подвергались реакциям химической модификации и после пиперидинового гидролиза наносились на секвенирующий гель. С помощью магнитных частиц достигалось быстрое и полное удаление реагентов, что не могло не привести к получению высококачественных результатов.

Интересный вариант метода секвенирования ДНК путем химической деградации с помощью только одного пиперидина и 0,5М NaCl известен как однодорожечное секвенирование [Ambrose, Pless, 1985,1987; Ambrose et al., 1988]. Несмотря на некоторые сложности при "чтении" радиоавтографа геля, заставляющие учитывать не только интенсивность полос, соответствующих определенным азотистым основаниям (A:C:G:T - 8:4:4:1), но и вертикальное расстояние между ними, где порядок уже следующий: G > Т > А > С. Однако такой гидролиз не выявлял разницы между цитозиновыми и гуаниновыми остатками и их приходилось различать по подвижности, принимая во внимание, что полосам цитозина предшествовал больший промежуток от вышестоящей полосы по сравнению с гуаниновыми полосами. В дальнейшем была исследована возможность использования для гидролиза молекул ДНК различных аминов, дающих разницу между G- и С-остатками, и такие были найдены, но при этом, к сожалению, не выявлялась разница между Т и А [Testoff, Pless, 1991]. К преимуществам данного способа относится также и то, что отпадает необходимость обращения с такими вредными реагентами, как диметилсульфат и гидразин, хотя не менее опасный пиперидин все же остается. Справедливости ради надо заметить, что данный способ секвенирования ДНК, несмотря на некоторые незначительные преимущества, так и не стал массовым.

Следует отметить, что из-за того, что пиперидин является предшественником в синтезе фенилциклидина и его продажа и использование в США строго регулируется, были попытки заменить его более безопасным пирролидином, имеющим сходные характеристики и требующим всего 15 мин инкубации (вместо 30 мин для пиперидина) при 90°С для расщепления модифицированных цепей ДНК [Shi, Tyler, 1989], однако широкого распространения это не получило.

Сообщается о секвенировании ДНК путем химической деградации, завершаемого в одну стадию с помощью одного N-метилформамида в присутстви ионов марганца сразу всех четырех типов оснований [Negri et al., 1996]. Авторы продемонстрировали возможность однодорожечного разделения продуктов секвенирующих реакций, причем как радиоактивно, так и флуоресцентно меченных по 5' -концу молекул ДНК. Эта же группа авторов исследовала механизм деградации формамидом 2'-деоксицитидина и пришла к выводу, что в случае замены последнего на 5-бромо-2'-деоксицитидин, производимой во время ферментативной амплификации фрагмента ДНК, заметно улучшается однодорожечное секвениро-вание ДНК путем химической деградации за счет лучшего распознавания остатков цитидина и тимидина, являющегося, обычно, главным источником ошибок [Saladino et al., 1997]. Весьма просто проблема одинаковой высоты пиков, принадлежащих остаткам гуанина и цитозина, в однодорожечном флуоресцентном секвенировании ДНК с помощью гидролиза пиперидином в присутствии NaCl была решена путем предварительной обработки ДНК диметилсульфатом, приводящим к метилированию гуанинов и формированию иного характера пиков, принадлежащих разным основаниям -G>A>C>T [Rosenthal et al., 1990].

Завершая данный раздел, следует отметить, что предложенное проведение реакций химической модификации и гидролиза в 96 лунках микротитратора [Church, Kieffer-Higgins, 1988] представляло собой некий элемент автоматизации и позволило значительно повысить производительность данного метода по сравнению с применявшимися ранее для этой цели полипропиленовыми пробирками [Maxam, Gilbert, 1980; Максам, Гилберт, 1986] и даже (для пиперидинового гидролиза) запаянными капиллярами [Maxam, Gilbert, 1977].