Принцип секвенирования днк по максаму-гилберту

Определение "Принцип секвенирования днк по максаму-гилберту" в ЭБНБ

Схема секвенирования ДНК химической деградацией

В основе метода секвенирования ДНК путем химической деградации лежит ограниченное расщепление меченого фрагмента ДНК под действием специфических реагентов. Непременным условием проведения секвенирования этим методом является наличие фрагмента ДНК, меченного только по одному концу. Разделение продуктов деградации по размеру с помощью высоковольтного электрофореза в полиакриламидном геле высокого разрешения, способного разделять фрагменты ДНК, различающиеся между собой по длине всего на один нуклеотид в достаточно широком диапазоне, и последующая радиоавтография геля позволяет определить нуклеотидную последовательность секвенированного участка ДНК.

Первым этапом при проведении реакции химической деградации является ограниченная модификация определенных нуклеотидов под действием различных химических агентов. Концентрация агента и продолжительность его воздействия на молекулы ДНК подбирается с таким расчетом, чтобы в каждой молекуле произошла модификация только одного нуклеотида, а поскольку в реакционной смеси присутствует огромное количество таких молекул, то, согласно теории вероятности, все основания данного типа в секвенируемом фрагменте ДНК окажутся модифицированными. Следующие этапы удаления модифицированных оснований и β-элиминации обоих фосфатов, окружающих дезоксирибозу, и разрыва цепи должны проходить уже количественно. Для каждого типа нуклеотидов или их комбинации проводят отдельные реакции ограниченной модификации и количественного расщепления. Таким образом, в результате четырех (или иногда трех, пяти или даже шести) типов реакций образуется смесь олигонуклеотидных молекул, различающихся по размеру на один нуклеотид и несущих на одном из концов метку, обычно радиоактивную. Следует отметить, что кроме меченых молекул в реакционной смеси будут представлены, и олигонуклеотидные фрагменты, не несущие метки, но на этапе радиоавтографии они окажутся невидимыми и поэтому для данного метода они как бы не существуют. После разделения продуктов реакции в соседних дорожках секвенирующего денатурирующего полиакриламидного геля и этапа радиоавтографии на рентгеновской пленке будет видна лестница из полос ДНК на соседних дорожках, "чтение" которой позволяет восстановить последовательность нуклеотидов секвенируемого фрагмента ДНК. На рис. в виде упрощенной схемы показан весь процесс определения последовательности нуклеотидов ДНК данным методом, из которого у читателя уже должно сложиться общее представление о секвенировании ДНК методом химической деградации.