Мечение фрагментов днк по максаму-гилберту

Определение "Мечение фрагментов днк по максаму-гилберту" в ЭБНБ

Как уже отмечалось выше, для определения нуклеотидных последовательностей ДНК методом Максама-Гилберта необходимо наличие фрагментов ДНК, несущих на одном из концов какую-либо метку. Отдельные частные случаи секвенирования ДНК методом химической деградации могут проводиться даже с немечеными препаратами ДНК. Концевое мечение секвенируемых фрагментов ДНК можно осуществить при помощи различных ферментов. Так, с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4 и молекулы АТФ, несущей радиоактивный фосфор в у-положении, проводится мечение 5'-концов одно- или двуцепочечного фрагмента ДНК. Эффективность мечения тупых или 5'-углубленных концов двуцепочечного фрагмента ДНК значительно ниже, чем 5'-выступающих. Для более эффективного мечения необходим предварительный этап дефосфорилирования фрагмента ДНК с помощью щелочной фосфатазы. Особая забота должна быть проявлена при последующем удалении щелочной фосфатазы, что достигается обычно фенольной депротеинизацией, так как остаточная фосфатазная активность может резко снизить эффективность этапа мечения. Мечение путем обменной реакции позволяет обойтись без этапа дефосфорилирования и требует присутствия в реакционной смеси в качестве акцептора молекул АДФ, однако эффективность мечения при этом будет значительно ниже.

Мечение 3'-концов двуцепочечного фрагмента ДНК можно провести с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I E. coli или ДНК-полимеразы фага Т4 и соответствующего меченного по α-положению дНТФ. Мечение З'-концов как одно-, так и двуцепочечного фрагмента ДНК можно осуществить с использованием терминальной трансферазы и меченного по ос-положению подходящего нуклеотидного предшественника. В случае с Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы I для эффективного мечения необходимо наличие фрагментов ДНК с выступающими 5'-концами, образованными при расщеплении ДНК определенными рестрикционными эндонуклеазами. Для этого необходимо добавление в реакционную смесь конкретного дНТФ, комплементарного первому нуклеотиду в выступающем участке молекулы (считая от двуцепочечного участка). В тех случаях, когда по какой-либо причине это невозможно, и имеющийся меченый дНТФ комплементарен следующим нуклеотидам, расположенным далее, в реакционную смесь необходимо добавить "холодные" (немеченные) соответствующие дНТФ, комплементарные первым нуклеотидам выступающего участка фрагмента ДНК. При этом следует учитывать, что чем дальше расположен нуклеотид, комплементарный меченому, тем более низкую эффективность мечения можно ожидать. Поскольку Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I имеет довольно низкую 3' → 5'-экзонуклеазную активность, то возможное мечение тупых и 3'-выступающих концов (за счет данной экзонуклеазной активности), которые могут находиться на противоположном конце фрагмента ДНК, можно не принимать во внимание ввиду неэффективности этого процесса. Однако добавление в реакционную смесь всех четырех дНТФ (один из которых меченый) позволяет полностью исключить эту вероятность, кроме случаев, когда для обоих концов будут требоваться одинаковые меченые дНТФ. Следует отметить, что добавление в реакционную смесь всех четырех дНТФ, включая меченый, в отдельных случаях может привести к образованию фрагментов ДНК с гетерогенными концами, непригодными для секвенирования, ввиду потенциально возможного включения в различные молекулы разного числа нуклеотидов.

Более высокая эффективность мечения может быть достигнута, если в результате расщепления фрагмента ДНК какой-либо рестрикционной эндонуклеазой образуются 5'-выступающие концы с одинаковыми нуклеотидами. Например, рестрикционная эндонуклеаза ЕсоRI генерирует выступающие концы со следующей последовательностью: 5'-ААТТ-3'. Таким образом, в результате мечения могут образоваться более высоко меченные фрагменты ДНК с двумя нуклеотидами, несущими метку (при добавлении в реакционную смесь "горячего" дАТФ). Однако при этом существует упоминавшаяся выше опасность неполного заполнения обоими этими нуклеотидами концов во всех молекулах, что приведет к наличию в образце ДНК, предназначенном для секвенирования гетерогенных фрагментов, отличающихся на один нуклеотид. Результатом этого может стать или очень высокий фон, затрудняющий достоверное "чтение" нуклеотидов с радиоавтографа геля, или полная невозможность его прочтения в случаях, когда в секвенируемом образце ДНК один из фрагментов или с одним, или двумя мечеными нуклеотидами будет представлен в достаточно высокой пропорции. Обойти это неудобство можно дополнительной инкубацией с добавлением в реакционную смесь (после завершения основной реакции мечения) этого же "холодного" дНТФ в высокой концентрации с целью гарантированного включения обоих нуклеотидов. Что касается фрагментов ДНК с такими концами, что в них теоретически может встраиваться только один нуклеотид, то и в этом случае ввиду не 100%-й эффективности мечения образуются гетерогенные фрагменты ДНК, однако поскольку один из них остается немеченным, то никакого вклада в заключительный радиоавтограф это не внесет.

Терминальная трансфераза осуществляет нематричный синтез полинуклеотидной цели ДНК и способна включать произвольное количество нуклеотидов на 3'-конце. Однако в связи с тем, что для секвенирования ДНК требуется наличие фрагментов с гомогенными мечеными концами, необходим этап щелочного гидролиза, обычно осуществляемого пиперидином, с целью удаления достроенных нуклеотидов, кроме первого, и остатка фосфорной кислоты от второго. Таким образом, фрагмент ДНК, меченый подобным образом, будет нести в своем 3'-конце один дополнительный нуклеотид и два меченых остатка фосфорной кислоты. Более простой путь, исключающий этап гидролиза, для получения фрагментов ДНК с гомогенными мечеными 3' -концами с помощью терминальной трансферы достигается при использовании в качестве меченого предшественника или дидезоксинуклеотид трифосфата, или кордицепин трифосфата, характеризующихся отсутствием гидроксильной группы в 3' -положении, делающем невозможным присоединение дальнейших нуклеотидов.

Интересный способ мечения 3' -выступающих концов, образуемых при расщеплении ДНК рестрикционной эндонуклеазой PstI с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I, заключается в предварительном отжиге пятичленного олигонуклеотида 5'-GTGCA-3', комплементарного выступающему участку данного рестрикционного фрагмента ДНК, в результате чего образуется конец нового типа с одним 5'-выступающим нуклеотидом G [Chirala, Wakil, 1986]. Авторы уверяют, что при добавлении в реакционную смесь необходимого радиоактивного дЦТФ эффективность мечения таких вновь полученных концов достигает 80%.

Следует отметить, что, несмотря на довольно большой выбор ферментов и соответствующих меченых нуклеотидов для мечения фрагментов ДНК по У- или 5'-концам, наиболее часто используемыми являются варианты с применением полинуклеотидкиназы фаза Т4 для мечения 5'-выступающих концов и Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I для мечения У -углубленных концов ввиду более высокой эффективности и относительной простоты данных процессов. Дополнительным удобством является то, что Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I хорошо работает в большинстве рестрикционных буферов, и, таким образом, реакции расщепления и последующего мечения можно проводить в одной пробирке и даже совместно, что впрочем нежелательно из-за все-таки имеющейся 3' → 5'-экзонуклеазной активности у этой ДНК-полимеразы.

При написании этого раздела намеренно не упоминался тип используемой метки, поскольку он может быть разным, но принципиальной разницы на этапе мечения не существует. Обычно при секвенировании фрагментов ДНК методом химической деградации в качестве радионуклида используется 32Р ввиду его более высокой энергии. Использование имеющих меньшую энергию радионуклидов 33Р и 35S также возможно, но при этом время экспозиции сильно увеличивается. При секвенировании фрагментов ДНК методом химической деградации применяются также и хемилюминесцентные, и флуоресцентные метки, но при этом требуется проведение несколько других (более сложных) процедур для выявления полос ДНК, чем простая радиоавтография на рентгеновскую пленку [Voss et al., 1989].