Ручное чтение нуклеотидной последовательности с радиоавтографа

Определение "Ручное чтение нуклеотидной последовательности с радиоавтографа" в ЭБНБ

Схема чтения нуклеотидной последовательности ДНК

Характер расщепления фрагментов ДНК в методе секвенирования путем химической деградации таков, что для "чтения" последовательности с радиоавтографа геля наиболее оптимальным вариантом является такой, когда при нанесении на гель одна дорожка (обычно первая) соответствует гуанину, вторая - пуринам, третья - пиримидинам и четвертая - цитозину (рис.). Таким образом, две средние дорожки содержат большее (кроме потенциально возможных частных случаев) число полос, чем крайние дорожки, поскольку в них видны фрагменты ДНК, ограниченные нуклеотидам и G, А и С, Т соответственно. Таким образом, эти две средние дорожки (G + А и С + Т) вместе содержат все полосы частичного расщепления меченой по одному из концов молекулы ДНК. Правильное "прочтение" полос, видимых на радиоавтографе геля, заключается, во-первых, в определении вертикальной позиции каждой конкретной полосы, соответствующей тому или иному нуклеотиду, относительно полос в соседних дорожках, относящихся к одному и тому же образцу ДНК, и, во-вторых, в выявлении типа нуклеотидов, к которому принадлежит данная полоса. Так, например, если полоса имеется только во второй дорожке - то это аденин, поскольку для другого пуринового основания - гуанина будет характерно наличие двух полос: в первой G-дорожке и совпадающей с ней полосой во второй G + А-до-рожке. Аналогично проводится и "чтение" пиримидиновых оснований, где полоса только в третьей дорожке указывает, что это тимин, а если эта же полоса имеется и в четвертой дорожке, то тогда это цитозин. Что касается более редко используемых реакций, приводящих к выявлению полос ДНК по типу А > С, А > G, G > А, С > Т, то в таких случаях требуется более сложное сопоставление наличия или отсутствия полос в соседних треках. Анализируя таким образом полосы одну за другой и поднимаясь вверх по радиоавтографу, необходимо достигнуть места, где полосы в соседних дорожках расположены так близко друг к другу, что уже невозможно различить их вертикальную последовательность. После этого "чтение" нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК с данного радиоавтографа можно считать законченным. Если же этот образец был нанесен на гель дважды, то для ранее нанесенного препарата на радиоавтографе будут видны фрагменты ДНК большего размера. В таком случае надо найти перекрывающиеся участки (что гораздо легче сделать, если в секвенируемой последовательности ДНК содержатся какие-нибудь характерные участки как, например, AAAAGGAAAA или им подобные, хорошо заметные глазом) и продолжить "чтение" данного образца ДНК, пока позволяет достигнутое в этом эксперименте разрешение. При этом при поиске перекрытий необходимо уделить особое внимание совпадению нуклеотидов в случаях секвенирования фрагментов ДНК, содержащих повторяющиеся элементы.

Особенности "чтения" радиоавтографа геля при секвенировании ДНК методом химической деградации по Максаму-Гилберту, включая разбор аномалий и вызвавших их причин, весьма подробно описаны в детальной статье Максама и Гилберта [Махат, Gilbert, 1980] и в ее русском переводе [Максам, Гилберт, 1986]. Поэтому заинтересованный читатель сможет ознакомиться с ними самостоятельно. Здесь же лишь скажем, что наиболее часто некоторые неоднозначности прочтения тех или иных нуклеотидов связаны с не совсем верным проведением реакций ограниченной модификации и пиперидинового гидролиза и, в частности, с присутствием остаточных количеств солей. Так, даже незначительное количество соли может служить причиной супрессии модификации тиминов гидразином. Возникают проблемы и при модификации других азотистых оснований. Пиперидин же в присутствии соли вызывает гидролиз не только модифицированных, но и не измененных оснований, приводя к высокому фону, видимому на радиоавтографе как сплошная лестница полос в каждой дорожке. Однако тщательное удаление следов соли, достигаемое, в том числе, простой промывкой осадка ДНК 70%-ным и затем 96%-ным этанолом, позволяет полностью исключить эту проблему. К серьезным затруднениям или даже невозможности "прочтения" последовательности ДНК может привести загрязнение секвенируемого фрагмента ДНК другим, также оказавшимся меченым, фрагментом.

В ферментативном методе секвенирования ДНК по Сэнгеру каждая дорожка соответствует только одному конкретному типу оснований (рис.) и поэтому для правильного "прочтения" радиоавтографа секвенирующего геля необходимо следить, чтобы какая-либо полоса содержалась только в одной дорожке, поскольку в противном случае точное установление данного нуклеотида будет затруднено или скорее просто невозможно. В связи с тем, что в отличие от картины полос секвенируемой ДНК по Максаму Гилберту в методе Сэнгера нет необходимости сопоставления наличия полос пуриновых или пиримидиновых оснований в одной или двух дорожках, то можно считать, что "чтение" радиоавтографа секвенирующего геля при этом будет несколько проще.

Однако в ранних экспериментах по секвенированию ДНК использование для построения комплементарной цепи Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I приводило к образованию на радиоавтографе секвенирующего геля полос разной интенсивности, что было следствием некоторой избирательности самого фермента при построении цепи ДНК и включения в нее специфических терминаторов - дидезоксинуклеотидтрифосфатов. Это сильно затрудняло "чтение" полос ДНК и иногда не позволяло провести однозначное "прочтение" некоторых нуклеотидов. В связи с этим были разработаны даже специальные правила "чтения" таких сложных участков [Bankier, Barrell, 1983]. Наибольшие трудности подстерегали экспериментатора на С-дорожке. Одиночные С-полосы часто бывают весьма слабыми, так что при слабой экспозиции геля есть вероятность пропустить такое основание. Такие же слабые С-полосы отмечаются для первого С из целого блока цитозиновых остатков, следующих друг за другом. Особую остроту вызывает тот факт, что второй С в таком участке обычно имеет наибольшую интенсивность, а поскольку вертикальное расстояние между полосами для блока цитозинов может быть уменьшено, это приводит к некоторой неясности их очертаний и, таким образом, весьма высока вероятность ошибочного "прочтения" таких участков. В то же время, чтобы не задерживать дальнейшее "чтение" радиоавтографа, для временного занесения в компьютер таких спорных нуклеотидов были придуманы специальные символы. Для примера ограничимся лишь некоторыми такими символами. Так, цифры 1, 2 3 и 4 обозначали, что это ВЕРОЯТНО С, Т, А и G соответственно. Буквой D обозначали нуклеотид(ы) С или СС в случаях, когда не могли определить это точно. Буквы V, В и Н служили для тех же целей для Т, А и G нуклеотидов.

Приведенные здесь далеко не все сложности и особые случаи "прочтения" нуклеотидной последовательности ДНК с радиоавтографа секвенирующего геля на сегодняшний день полностью потеряли свою актуальность и упомянуты здесь лишь с целью рассказать о трудностях, с которыми сталкивались исследователи при секвенировании ДНК в первые годы. Применяемые сегодня ДНК-полимеразы позволяют получать достаточно однородную картину полос ДНК на радиоавтографе и описанные выше проблемы практически не возникают.

Такой нежелательный эффект, как компрессия полос при электрофоретическом разделении одноцепочечных фрагментов ДНК, зависит от последовательности нуклеотидов на 3'-конце фрагмента ДНК и не зависит от используемой ДНК-полимеразы и поэтому существует и сейчас. Несмотря на различные способы, направленные на уменьшение компрессии, она все же доставляет экспериментаторам массу хлопот. Возникающая за счет формирования на 3'-конце фрагмента ДНК участка со вторичной структурой шпилька приводит к тому, что фрагменты ДНК, ее несущие, мигрируют в геле быстрее, как если бы они были короче. В результате заметно уменьшается вертикальное расстояние между последующими полосами, приводящее даже к опережению одними нуклеотидами других, и, следовательно, к неверному "прочтению" этого участка. Такие нуклеотиды, впрочем, могут быть достоверно определены при секвенировании противоположной цепи ДНК. Несмотря на то, что и для этой комплементарной цепи будет характерно формирование подобной шпильки, в этом процессе будут задействованы нуклеотиды, расположенные с другой стороны от центра шпильки и поэтому компрессия коснется именно их, а не тех, что были компрессированы при секвенировании исходной цепи ДНК.

Завершая этот раздел, хочется привести ряд неких правил, с которых начинается "чтение" нуклеотидной последовательности с радиоавтографа геля. Причем данные правила (кроме особо оговоренных случаев) действуют при секвенировании ДНК как ферментативным методом по Сэнгеру, так и методом химической деградации по Максаму-Гилберту. Перед началом "чтения" необходимо провести беглый осмотр радиоавтографа секвенирующего геля, направленный на выявление недоэкспозиции или переэкспозиции; возможного высокого фона; размытости полос; присутствия дополнительных полос в соседних дорожках (для метода Сэнгера). Все эти факторы затрудняют чтение или делают его совсем невозможным и поэтому необходимо принять решение, что делать дальше. В результате недостаточной экспозиции некоторые слабые полосы могут быть не видны и в таком случае, если возможно, необходимо повторить этап радиоавтографии, увеличив соответственно время экспозиции (если, конечно, это допустимо и гель с радионуклидом 32Р уже не экспонировался две недели). Переэкспозиция также может быть нежелательна, поскольку затрудняет "чтение" полос в верхней части геля (особенно меченных 32Р), но она относительно легко поправима. Прочие недостатки радиоавтографа (кроме размытости полос, которая может быть также следствием и плохого контакта геля с рентгеновской пленкой) этапом радиоавтографии уже не устранимы. И в случае невозможности достоверного "прочтения" нуклеотидной последовательности необходимо осуществить или повторное электрофоретическое разделение тех же продуктов секвенирующих реакций или провести эти реакции заново, что зависит от характера видимых на радиоавтографе артефактов и при этом изменить какие-то условия их проведения.

Приняв решение "читать" радиоавтограф секвенирующего геля, можно предпринять следующие действия, хотя они далеко не обязательны для опытного и внимательного экспериментатора. Как показывает опыт, значительное число ошибок при "чтении" радиоавтографа образуется за счет перескакивания взгляда на соседние дорожки, относящиеся к другой матрице, особенно в случаях не оставленной пустой дорожки между разными образцами ДНК. Избежать этого можно, проведя фломастером разграничительные линии или даже изготовив специальную маску, оставляющую открытой только четверку "читаемых" дорожек. Желательно, начав "чтение" радиоавтографа, завершить его до конца, но при каких-то вынужденных остановках необходимо сделать отметку на радиоавтографе для возобновления дальнейшего "чтения". Это особенно важно в случаях секвенирования ДНК, содержащей повторяющиеся последовательности, о чем уже упоминалось немного выше при описании выявления участков перекрытия. Другой тип ошибок, который может произойти при "чтении", заключается в используемых различных порядках нанесения образцов ДНК на секвенирующий гель. Так, при постоянном нанесении, например, в порядке GATC другой характер нанесения при недостаточной опытности и внимательности экспериментатора неминуемо приведет к некоторым ошибкам, поэтому можно порекомендовать всегда придерживаться избранного порядка, кроме случаев, когда он должен быть каким-то определенным. Иногда "чтение" полос ДНК необходимо начинать с самого низа радиоавтографа, с того места, где возможно их однозначное "прочтение". Так бывает, например, при секвенировании ДНК по методу Максама-Гилберта после элюции какого-либо фрагмента из геля или по методу Сэнгера в случае эффективного разделения крупных фрагментов ДНК, когда последовательности, принадлежащие векторной молекуле, давно вышли из геля. Однако весьма часто на радиоавтографе геля бывает видна и последовательность ДНК-вектора. В этих случаях необходимо обнаружить границы клонированной вставки с тем, чтобы исключить уже на этапе "чтения" векторную последовательность. В одной работе даже была предложена сделанная компьютером иллюстрация радиоавтографа секвенирующего геля с изображенным на нем полилинкером из вектора pUC19, как бы "прочитанная" в обоих ориентациях с помощью прямого и обратного праймеров [Carmack, 1990]. Автор предлагал использовать ее в качестве некоего шаблона для облегчения поиска участков полилинкера, но при этом необходимо заметить, что изображенные полосы ДНК соответствуют матрице как бы "нанесенной" на гель в последовательности GACT, практически никогда не применяемой.

Кроме самих полос ДНК, особое внимание должно уделяться и вертикальным промежуткам между ними. Так, группа сильно приближенных к друг другу полос может свидетельствовать об имеющейся в этом месте компрессии ДНК. Дополнительным аргументом того, что здесь имеется компрессия, может быть увеличенное вертикальное расстояние между полосами, наблюдаемое несколько выше. Подобное происходит вследствие того, что формирующаяся на 3'-конце новосинтезиро-ванной цепи ДНК шпилька увеличивает подвижность таких фрагментов ДНК, а уже для более крупных фрагментов, несущих дополнительные нуклеотиды после шпильки, эта структура становится менее стабильной, вторичная структура исчезает и, как следствие, межполосное расстояние возвращается к прежнему, приводя таким образом к созданию небольшого участка с увеличенным вертикальным расстоянием между соседними полосами. Выявление таких участков с компрессией полос ДНК крайне важно для правильного "прочтения" этого отрезка нуклеотидной последовательности и в случае невозможности этого -обращение повышенного внимания к этому участку при секвенировании комплементарной цепи ДНК. Увеличенное (двойное) расстояние между полосами может быть также результатом пирофосфорилиза и в этом случае установление типа отсутствующего нуклеотида возможно после секвенирования комплементарной цепи ДНК.

Наиболее типичный путь переноса нуклеотидной последовательности с радиоавтографа геля в компьютер рассматриваемым здесь ручным методом лежит через предварительную запись этой последовательности на бумагу. Последующее введение данной последовательности нуклеотидов осуществляется с помощью клавиатуры. Таким образом, подобное введение "бессмысленных" текстов в виде беспорядочного набора букв G, А, Т, С и редко N в компьютер таит в себе еще источник ошибок. Чтобы исключить такие ошибки, в разных компьютерных программах предусмотрено или двойное введение нуклеотидной последовательности, с высокой вероятностью позволяющее выявить несовпадение отдельных нуклеотидов при их повторном занесении, или использовании музыкальных звуков, сигнализирующих о вводе того или иного нуклеотида [Hutchinson, 1986]. "Прочитывание" компьютером с помощью синтезатора речи занесенной последовательности нуклеотидов позволяет осуществлять ее контроль следя по сделанной записи или радиоавтографу.

Однако при осуществлении крупных проектов по секвенированию этап "чтения" нуклеотидной последовательности с радиоавтографа геля становится достаточно "узким местом", что вызвало разработку специальных приборов, осуществляющих полуавтоматическое и автоматическое считывание последовательности нуклеотидов и ее занесение в компьютер.