Полу- и автоматическое чтение радиоафтографа

Определение "Полу- и автоматическое чтение радиоафтографа" в ЭБНБ

Полуавтоматичекое чтение радиоавтографа геля основано на применении планшетного дигитайзера со специальной ручкой, сопровождаемое использованием специализированных компьютерных программ [Gingeras et al., 1982; Lautenberger, 1982; Komaromy, Govan, 1984; Staden, 1984]. Сущность данного подхода заключается в размещении радиоавтографической пленки на планшетном дигитайзере с подсветкой и касании его поверхности сигнальной ручкой, передающей в компьютер оцифрованные X и Y координаты каждой полосы. Предварительно касанием четырех углов каждой дорожки, соответствующей определенному нуклеотиду, задаются ее координаты и присваивается тип нуклеотида. В дальнейшем поочередным касанием сигнальной ручки полос ДНК на радиоавтографе, исходя из тех же правил "чтения" нуклеотидной последовательности, описанной в предыдущем разделе, осуществляется занесение в компьютер соответствующего нуклеотида и всей последовательности в целом. Для исключения возможных ошибок в эту систему был добавлен синтезатор речи, проговаривающий по желанию экспериментатора занесенные нуклеотиды [Gingeras et al., 1982].

Выпуск различных вариантов подобных дигитайзеров, несколько отличающихся по своим возможностям и конструкциям, был налажен многими фирмами. Однако, учитывая высокую стоимость планшетного дигитайзера, было предложено также полуавтоматическое "чтение" последовательности нуклеотидов с радиоавтографа геля, основанное на использовании более дешевой специализированной компьютерной мыши. Так, на протяжении некоторого времени швейцарская фирма "Integra Bioscience AG" поставляла компактную систему SequenceBoy, представляющую собой отдельный блок с небольшим дисплеем и памятью и минимальным количеством клавиш, служившую дешевой альтернативой компьютеру. Она комплектовалась специализированной компьютерной мышью Readermouse, предназначенной для ручного чтения радиоавтографа геля, лежащего на столе с подсветкой, и занесения нуклеотидной последовательности в компьютер нажатием соответствующих клавиш (ACGT и N) без применения клавиатуры самого компьютера.

Таким образом, существующие полуавтоматические системы чтения избавили экспериментаторов лишь от этапа занесения "прочитанной" последовательности нуклеотидов в компьютер, оставив ему возможность осуществлять само "чтение" все равно вручную.

Дальнейшее усовершенствование "чтения" радиоавтографа секвенирующего геля действительно сделало этот процесс полностью автоматическим [Elder et al., 1986]. Примененный крупноформатный цифровой сканер с соответствующим программным обеспечением позволил проводить довольно скоростное (5 мин на 4 трека) "чтение" нуклеотидной последовательности с точностью около 99%. Изображение секвенирующего геля на радиоавтографе не может быть идеальным, если понимать под этим униформность полос, пропорциональное вертикальное расстояние между ними, неискривление треков и т.д. При "чтении" радиоавтографа глазами, человеческий мозг в состоянии вносить коррективы, исходя из имеющегося опыта, но простое сканирование радиоавтографического изображения без учета соответствующих поправок приводило бы к значительным ошибкам. Поэтому была разработана специальная компьютерная программа, способная корректировать возникающие искажения электрофоретического разделения фрагментов ДНК, узнавать полосы ДНК по их характерной форме, оценивать интенсивность полос и их взаимное расположение. Проведенное авторами цитируемой работы интересное сравнение точности "чтения" одной и той же последовательности с радиоавтографа геля экспериментаторами разного уровня подготовки и данной автоматической системой показало, что предложенный метод автоматического "чтения" ничуть не уступает качеству "чтения" опытным экспертом. Сравнительный анализ ошибок, происходящих на этапе "чтения" радиоавтографов геля как с помощью дигитайзера, так и автоматическим прибором, был проведен другими авторами [Khurshid, Beck, 1993]. В данной работе учитывались различные типы ошибок в виде неверно "прочитанных" нуклеотидов, вставок, делеций, отсутствующих нуклеотидов, а также неоднозначно определяемых. Однако к серьезному недостатку данного анализа можно отнести то, что во всех этих случаях секвенирование ДНК выполнялось с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I, a этот фермент известен тем, что включение ддНМФ в растущую цепь ДНК производит неравномерно и в сильной зависимости от окружающей последовательности ДНК. Можно предположить, что подобный анализ мог бы дать заметно отличающиеся результаты, проводись он с радиоавтографами секвенирующих гелей, полученных с помощью секвеназы.

Дальнейшее развитие подобной системы привело к созданию еще более совершенного прибора для быстрого (5 мин на 4 дорожки) автоматического "чтения" и занесения "прочитанной" последовательности в компьютер в сочетании с удобным компьютерным обеспечением [West, 1988]. Разработка подобной техники продолжалась и в дальнейшем. Так, был создан высокопроизводительный прибор для автоматического чтения радиоавтографов секвенирующих гелей, использующий принцип обратной свертки и "читающий" последовательность ДНК со скоростью 5 нуклеотидов/с с уровнем ошибок около 1% [Ives et al., 1994].

Упомянутые выше подходы к "чтению" радиоавтографа секвенирующего геля требуют применения специализированного оборудования. В то же время существует возможность использования обычных сканеров как планшетных, так даже и ручных для сканирования радиоавтографов геля. Фирма "Jandel Scientific Software" (Германия) поставляет компьютерную программу SigmaGel, специально предназначенную для анализа сканированного с помощью обычных сканеров изображения полос ДНК на радиоавтографе секвенирующего геля с возможностью дальнейшей обработки полученных результатов.

Нельзя не отметить одну работу по реконструированию сканированного радиоавтографа секвенирующего геля [Noolandi et al., 1993]. Особенностью данной работы было то, что разделение образцов ДНК проходило в условиях пульс-электрофореза и авторы, задавшись целью "прочитать" последовательность ДНК как можно дальше, сканировали радиоавтограф с разрешением 600 пикселей на дюйм и с помощью компьютера увеличили изображение. Они сообщают об уверенном "чтении" полос ДНК в интервале 970-1320 нуклеотидов, где их плотность составляла около 10 на 1 мм. В зоне, отошедшей от колодцев только на 13,5 см, плотность полос достигала уже около 25 на 1 см и сплошное "чтение" было уже невозможно, но отдельные нуклеотиды в районе 2332 все же могли быть распознаны.

Использование специальных CCD-камер, требующих сильного охлаждения или жидким азотом, или с помощью элементов Пельтье, как, например, в приборе SpeedReader фирмы "IntelliGenetics, Inc." (США), регистрирующих и передающих изображение на экран компьютерного монитора, освободило экспериментатора от рутинной работы по "чтению" и последующему занесению в компьютер последовательности нуклеотидов. Соответствующее компьютерное обеспечение было способно компенсировать искажения полос ДНК с целью получения достоверных результатов [Drury et al., 1993; Elder, 1990; Sanders et al., 1991; Wu, Mislan, 1993]. Высокая чувствительность CCD-камер в сочетании с хорошей линейной зависимостью и быстротой получения результатов делает их достаточно удобными для сканирования результатов секвенирова-ния ДНК. Подобная CCD-камера была использована для регистрации результатов секвенирования ДНК с помощью хемилюминесценции непосредственно с мембранного фильтра без обычного этапа радиоавтографии [Karger et al., 1992]. 30 мин экспозиции в темноте оказалось достаточно для детекции сигналов свечения, испускаемого производным 1,2-диоксетана. Их последующая оцифровка с помощью соответствующих компьютерных программ позволила "прочитать" нуклеотидную последовательность секвенируемого участка ДНК. В своей следующей работе авторы провели детальный анализ особенностей сканирования с помощью усовершенствованной CCD-камеры мембранных фильтров с секвенированной ДНК, выявляемой хемилюминесценцией [Karger et al., 1993]. В том числе было рассмотрено применение специальных фильтров для уменьшения отрицательного влияния космических лучей на заключительное изображение полос секвенируемой ДНК.

Упомянутые в предыдущем разделе специальные приборы Cyclone, Instantlmager ("Packard", США) и Phosphorlmager ("Molecular Dynamics", США), детектирующие наличие радионуклидов (32Р, 33Р и 35S) прямо в геле, с помощью компьютерных программ (например, DNAscan для прибора Phosphorlmager) сразу заносят считываемые полосы ДНК в виде текстового файла с последовательностью нуклеотидов в компьютер. Причем данные программы способны корректировать возможные искажения в геле, такие как "улыбка", искривление треков и др., что позволяет получать достоверные данные.