Радиоиммунный анализ йодсодержащих компонент сыворотки

Определение "Радиоиммунный анализ йодсодержащих компонент сыворотки" в ЭБНБ

Присутствующие в норме йодсодержащие компоненты сыворотки легко определяются методами радиоиммунного анализа (РИА). Его принцип состоит в оценке скорости реакции конкурентного взаимодействия измеряемого лиганда (S) и его меченого (обычно I¹³¹) изотопом аналога (S*), которые выступает в качестве антигенов, со специфическими антителами - иммуноглобулинами класса G, присутствующими в антисыворотке (антитела - АТ). Антисыворотка может быть поликлональной или содержать моноклональные IgG.

Реакция подчиняется закону равновесия масс. Так, в состоянии равновесия, концентрация S*, связанного с AT в форме комплекса АТ-S*, обратно пропорциональна концентрации S, формирующего комплекс AT-S при условии, что концентрации AT и S* постоянны.
AT-S* + (S) = AT-S + S*

Определение уровня радиоактивности проб AT-S* или свободного (не связавшегося с антителами) S* проводится после их разделения посредством преципитации комплекса антитело-антиген или адсорбции свободного лиганда на индифферентном носителе. Иногда РИА проводится с антителами, фиксированными на твердом носителе, реагирующими с S и S* в растворе. Добавление известного количества S проводится для построения стандартной кривой, описывающей стехиометрическую взаимосвязь между концентрациями AT-S* и S. Эта кривая может быть преобразована в прямую линию в результате математических операций. Отрицательные пробы содержат свободный S*, но не содержат специфических антител к S* или избыточного количества S. Чувствительность метода зависит от аффинности антител и специфических свойств S*. При оптимальных условиях чувствительность метода позволяет определить концентрацию лиганда порядка 1 пг.

Эффективная продукция антител требует презентации антигенов - йодированных аминокислот, посредством конъюгации с альбумином или с какими-либо другими белковыми молекулами или частицами. При проведении определения концентрации йодированные аминокислоты должны быть освобождены от связи с сывороточными связывающими протеинами, главным образом тироксинсвязывающим глобулином (ТСГл), так как константы сродства к транспортным белкам часто эквивалентны константам связывания с иммуноглобулинами. Метод исследования включает экстракцию, конкурентное замещение определяемых аминокислот и инактивацию ТСГл. В идеальном случае, конкурирующие за места связывания соединения должны замещать йодированные аминокислоты в ТСГл, но незначительно или вообще не вмешиваться в протекание специфической иммунной реакции.

Метод радиоиммунного анализа позволяет проводить измерения в образцах цельной необработанной сыворотки. Хотя влияния негормональных йодсодержащих компонентов практически не наблюдается, определенное перекрестное реагирование между связанными, присутствующими в сыворотке в норме другими йодированными аминокислотами, все же существует. Таким образом, проведение валидного исследования требует отбора антител, которые обладают незначительной перекрестной реактивностью или вообще ее не имеют. Это особенно важно, когда концентрация измеряемого вещества ниже, чем концентрация перекрестно реагирующих синергистов. Связывание с иммуноглобулинами редко позволяет дифференцировать L- и D-изомеры йодтиронинов, но это не имеет существенного значения при клинической оценке. Иногда у некоторых пациентов в системной циркуляции присутствуют также антитела к йодтиронинам, что влияет на проводимый РИА в неэкстрагированных образцах сыворотки. В зависимости от метода, применяемого для разделения связанного и свободного лиганда, получаемые результаты могут быть либо заниженными либо завышенными в присутствии таких антител.

Широкий выбор коммерческих наборов для проведения подобных исследований доступен для большинства методов РИА, что делает его приемлемым для всех медицинских центров. Модификации методов РИА позволяют производить измерение содержания Т4 в небольших образцах сухих капель крови на фильтровальной бумаге, что нашло применение в скрининге неонатального гипотиреоидизма.

Первые методы, разработанные для измерения содержания йодированных аминокислот, использующие только что описанный принцип, не включали использование антител. Нативный сывороточный протеин, ТСГл, использовался вместо антител для измерения уровня Т4 в экстрагированной сыворотке. Этот метод оценки конкурентного связывания с белками был постепенно вытеснен методами РИА.