Секвенирование днк мультиплексное

Определение "Секвенирование днк мультиплексное" в ЭБНБ

Мультиплексное секвенирование ДНК ферментативным методом

Мультиплексное секвенирование ДНК, основанное на одновременном использовании целого набора плазмидных векторов plex00-20, было разработано первоначально для метода секвенирования ДНК путем химической деградации с целью повышения его производительности [Church, Kieffer-Higgins, 1988]. Однако наибольшее развитие этот подход получил при секвенировании ДНК ферментативным методом по Сэнгеру. Несмотря на то, что и имеющиеся плазмидные вектора plex00-20 могут быть применимы для секвенирования с помощью дидезокситерминаторов, на основе одноцепочечного вектора М13 и некоторых из этих векторов (последовательность "тэгов" которых не нарушала рамку считывания галактозидазного гена), все же было сконструировано 11 новых М13р1ех векторов, позволяющих проводить ферментативное мультиплексное секвенирование по нарабатываемым одноцепочечным матрицам ДНК [Heller et al., 1991]. Сообщается об использовании набора из пяти векторов Plex, для которых характерно наличие мест отжига для Е и Р секвенирующих праймеров [Creasey et al., 1991].

Мультиплексное секвенирование ДНК мультиплексным мечением

Главный принцип секвенирования ДНК с помощью мультиплексного подхода заключается в одновременном проведении терминирующих реакций со всеми секвенируемыми матрицами ДНК, клонированными изначально в различных специализированных векторах. Затем следует их разделение в секвенирующем полиакриламидном геле, перенос на мембранный фильтр и фиксация перенесенных фрагментов ДНК на этом фильтре. Таким образом, на фильтре оказываются фиксированными "невидимые" лестницы полос всех исследуемых фрагментов ДНК. Для их выявления необходимы этапы молекулярной гибридизации с мечеными олигонуклеотидными зондами, гомологичными каждый раз фрагменту только одного определенного вектора из пула использованных. Так, 20 самостоятельных плазмидных векторов plex00-20 несут по два различающихся участка для отжига праймеров каждый, что составляет 40 вариантов "тэгов". Аналогичными "тэгами" располагают и одиннадцать М13р1ех и пять Plex векторов. В результате гибридизации с каким-либо меченым олигонуклеотидным праймером после радиоавтографии на рентгеновской пленке становились видны полосы ДНК, принадлежащие только одной конкретной матрице. Для выявления следующего клона необходим этап полного удаления первого меченого зонда и повторная гибридизация с новым зондом. И так столько раз, сколько матриц в различающихся векторах было первоначально взято в исследование.

Следует отметить, что необходимым условием осуществления мультиплексного секвенирования ДНК является перенос фрагментов ДНК из полиакриламидного секвенирующего геля на мембранный фильтр, поскольку проведение всех этих последовательных процедур гибридизации, окрашивания, отмывки возможно только с мембранным фильтром. Второе условие заключается в прочной сорбции фрагментов ДНК на данном фильтре, выдерживающей многократные инкубации в различных растворах. В противном случае мультиплексное секвенирование будет просто невозможно. Немаловажное значение имеет тип используемой метки. Так, при использовании радиоактивной метки процесс выявления последовательностей всех матриц ДНК довольно продолжителен ввиду требующейся длительной экспозиции фильтра на рентгеновскую пленку, занимающей иногда несколько суток. Гораздо быстрее результаты могут быть получены с помощью хемилюминесценции такого субстрата, как 1,2-диоксетан. Считается, что каждый цикл мультиплексного секвенирования с его использованием требует 1 ч на гибридизацию с меченой пробой и 1,5 ч на все процедуры по выявлению гибридизационных сигналов [Creasey et al., 1991].

Обычно мультиплексное секвенирование проводится с немеченными фрагментами ДНК и уже потом выявление на фильтре секвенируемых полос ДНК зависит от специфической пробы, меченной тем или иным соединением (радиоактивностью, биотином и др.), что делает неизбежным этап блот-гибридизации. Однако было предложено интересное решение по мультиплексному секвенированию нескольких матриц ДНК, не требующее этапа гибридизации со специфическими пробами. Суть этого способа заключается в одновременном разделении в одном геле по-разному меченных фрагментов ДНК, принадлежащих конкретным матрицам, и поэтому авторы назвали этот метод мультиплексным мечением [Olesen et al., 1993]. Так, ими в качестве праймеров были использованы олигонуклеотиды, меченные по 5*-концу разными гаптенами: биотином, дигоксигенином, 2,4-динитрофенилом и флуоресцеином. В результате терминирующих реакций, секвенирующего электрофореза, переноса фрагментов ДНК из геля на мембранный фильтр, проводимых одновременно со всеми этими матрицами, появилась возможность сразу, без этапа гибридизации, последовательно выявлять на фильтре полосы ДНК, соответствующие определенным матрицам, что в значительной мере способствовало более быстрому получению данных. Одно из главных отличий этого подхода от обычного мультиплексного секвенирования заключается в том, что здесь электрофоретическому разделению подвергаются продукты терминирующих реакций, уже несущие определенные, различные для каждой матрицы метки. Однако для выявления меченных ими фрагментов ДНК, перенесенных на мембранный фильтр, необходимо проведение соответствующих последовательных процедур. Для подобного секвенирования не требуется клонирования или переклонирования вставки в специализированном векторе, поэтому в качестве зондов (в данном случае - секвенирующих праймеров) могут выступать стандартные универсальные праймеры, меченные по 5'-концу различными гаптенами. Таким образом, становятся необходимы только этапы связывания конъюгата антител к соответствующему гаптену и щелочной фосфатазы (или комплекса стрептавидин/щелочная фосфатаза для биотина) и затем с помощью хемилюминесценции 1,2-диоксетанового субстрата выявления полос ДНК на фильтре (рис.).

Авторы показали, что наибольшую чувствительность имеет система с биотинилированным праймером. В 8 раз худшая чувствительность отмечалась ими при использовании флуоресцеинового гаптена и в 16 -для дигоксигенина и 2,4-динитрофенила. Поскольку при многократных этапах выявления полос ДНК и их последующего удаления с фильтра все же происходит незначительный смыв сорбированных фрагментов ДНК, то в цитируемой работе рекомендовалось последовательное выявление секвенируемой ДНК, несущей дигоксигениновый и/или динитрофенильный гаптены, затем флуоресцеиновыи гаптен, и в завершение - биотинилированную метку.