Секвенирование больших днк делеционными субклонами in vivo

Определение "Секвенирование больших днк делеционными субклонами in vivo" в ЭБНБ

События интрамолекулярной коинтеграции, связанные с наличием в векторе транспозируемых элементов, приводят к образованию дочерних молекул, несущих делеции определенных участков. Такие делеции происходят с фиксированных мест транспозона в варьирующие места прилегающего участка ДНК, который в данном случае представляет собой клонированный фрагмент ДНК, предназначенный к секвенированию. С целью получения субклонов, несущих подобные делеции, были созданы различные специализированные вектора для секвенирования протяженных фрагментов ДНК, несущие в своем составе разные транспозоны. Учитывая то, что транспозиция происходит не с очень высокой частотой, для каждого типа векторов были разработаны соответствующие штаммы Е. coli, позволяющие в определенных условиях осуществлять поиск нужных субклонов, обычно по признаку летальности, т.е., в этом случае после транспозиции на чашке Петри вырастали только делеционные варианты исходного фрагмента ДНК.

Так, одним из первых было создано целое семейство векторов с транспозоном Тп9, позволяющим получать направленные делеции вставки, позитивной селекцией для которых служила способность бактериального клона расти на галактозе [Ahmed, 1984, 1985, 1987, 1989]. Первые вектора этого семейства рАА3.7 и рАА3.7Х представляли собой плазмиду, несущую элементы фага лямбда и транспозона Тп9, позволяющие наращивать только двуцепочечную ДНК [Ahmed, 1984, 1985]. Дальнейшее улучшение вектора рАА113Х состояло в добавлении в его последовательность ориджина репликации из одноцепочечного фага M13, что сделало этот вектор фагмидным и привело к возможности нарабатывать одноцепочечную ДНК [Peng, Wu, 1986, 1987]. Сам автор этого семейства векторов на основе плазмиды рАА3.7Х создал космиду рАА113Х, позволяющую клонировать большие вставки протяженностью около 40 тпн и с помощью транспозона Тп9 получать направленные делеции клонированного фрагмента ДНК [Ahmed, 1987]. Следующий вектор pAA113M, отличающийся от предыдущего вектора наличием ориджина репликации одноцепочечного фага М13, был предназначен для получения уже одноцепочечных вариантов генерируемых субклонов [Ahmed, 1989]. Состыковка нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, субклоны которых были получены in vivo с помощью транспозона имеет одну особенность, которую надо принимать во внимание. Так, в каждом секвенированном участке будет присутствовать блок короткой последовательности, принадлежащий транспозону, но, как наглядно продемонстрировал Ахмед в своей работе, при этом не образуется каких-либо нежелательных аберраций в месте стыка на этапе субклонирования [Ahmed, 1985]. Транспозон Тп9 характеризуется некоторой избирательностью по отношению к последовательности ДНК, в которую он встраивается, что имеет иногда некоторые отрицательные последствия.

На основе плазмиды pBR322 были сконструированы два вектора рАР13 и рАР18, позволяющие осуществлять делеции вставки in vivo за счет встроенного в эти вектора транспозона IS1 и получать необходимые субклоны для секвенирования последовательности ДНК всей вставки [Prentki et al., 1991]. Отбор делеционных вариантов производился на основе устойчивости клеток к стрептомицину. Ферментативное секвенирование ДНК проводилось с помощью олигонуклеотидного праймера, гомологичного IS1 транспозона. Созданный вектор pALF, несущий транспозон IS1, cos-сайты фага лямбда и прочие регуляторные и маркерные элементы, был с успехом применен для получения делеционных вариантов крупной (около 40 тпн) вставки ДНК дрозофилы, вызванных внедрением данного транспозона [Ahmed, Podemski, 1997]. В качестве секвенирующего праймера здесь также, как и в предыдущей работе, служил олигонуклеотид, гомологичный участку IS7 транспозона.

С участием другого транспозона Тп1000 был сконструирован весьма интересный космидный вектор pDUAL, несущий три гена устойчивости к разным антибиотикам [Wang et al., 1993]. Особенностью данного вектора, разработанного для специальной стратегии секвенирования, названной авторами "фабрикой делеции in vivo", является возможность одновременного получения двунаправленных делеционных вариантов, отбираемых по устойчивости к двум разным антибиотикам и двум селективным летальным маркерам. Характерной чертой дельта/гамма транспозиций является то, что первые пять нуклеотидов в секвенируемом сегменте ДНК вставки после постоянного участка самого транспозона представляют собой преимущественно А + Т нуклеотиды. В своей предыдущей работе авторы показали, что места внедрения транспозона γδ или Tn1000 распределяются достаточно равномерно, хотя даже в GC-богатых участках ДНК внедрение все же чаще отмечается в АТ-блоках (Strausbaugh et al., 1990). Ранее на основе этого же транспозона Tn1000 этими же авторами был создан более простой специализированный вектор и в нем получена серия успешно секвенированных субклонов гена avtA кишечной палочки [Liu et a., 1987]. Они же получили конструкцию mγδ-1, являющуюся малым дериватом транспозона Tn1000, и показали ее пригодность для крупномасштабного секвенирования ДНК путем создания направленных делеций вставки in vivo [Berg etal., 1991].

Другой вектор рММ251, предназначенный для генерации делеций вставки in vivo, также представляет собой весьма сложную конструкцию, в которую встроены регуляторные элементы фага лямбда, инвертированные повторы транспозона Тп3. Механизм получения однонаправленных делеций в данном векторе основан на том, что in vivo происходят делеции с фиксированных точек инвертированных повторов до вариабельных точек соседнего (клонированного) фрагмента ДНК [Sugino, Morita, 1994]. Преимуществом данной системы является то, что подобные делеции вставки с этим вектором можно осуществлять и in vitro, просто добавляя фермент Tn3 транспозазу [Morita et al., 1987; Ichikawa, Ohtsubo, 1990]. В своей следующей работе авторы реализовали эту возможность, добившись более быстрых результатов при получении необходимых субклонов, добавляя в реакционную смесь, содержащую ДНК вектора со вставкой, предварительно гидролизованную соответствующей рестрикционной эндонуклеазой, Tn3 транспозазу, представляющую собой практически неочищенную аммонийсульфатную фракцию клеточного лизата клона Е. coli, несущего плазмиду с суперпродукцией данного фермента [Morita et al., 1987].

Сообщается о сконструированной космиде, несущей мини-дериват транспозона Тп5, сконструированной специально для выполнения проекта по секвенированию полного генома кишечной палочки [Kasai et al., 1992]. Ранее с помощью участка этого транспозона Тп5 протяженностью всего 264 пн была создана конструкция на основе фага лямбда, позволяющая проводить систематическое секвенирование, стартуя с по-разному удаленных мест вставки, за счет внедренного транспозона с использованием для отжига праймера его консервативной последовательности [Phadnis et al., 1989]. Применение метода ПЦР позволило в значительной степени усовершенствовать этот процесс такого систематического секвенирования вставки в данном векторе на основе фага λ [Krishnan et al., 1991].

Еще одним транспозоном, применяемым для получения делеций in vivo, является транспозон Мю, характеризующийся наибольшей частотой транспозиции среди известных транспозонов. На его основе создан специализированный вектор, с помощью которого определена нуклеотидная последовательность довольно протяженного фрагмента гена гиразы В Е. coli [Adachi et al., 1987].

Однако все эти векторы и векторные системы имеют существенный недостаток. Поскольку проведение подобных делеционных процедур требует использования специальных штаммов Е. coli и весьма сложной схемы их выращивания, это служит некоторым препятствием к их широкому использованию. Другими отрицательными моментами, особенно для векторов, рассчитанных на клонирование крупных фрагментов ДНК, являются некоторая нестабильность вставки, трудности в ее реориентации, вызванной необходимостью "читать" другую цепь ДНК. Также для большинства транспозонов характерным является сосредоточение мест их внедрения у дистального конца вставки по сравнению со значительно меньшей частотой данных событий в центральной и проксимальной частях [Ahmed, Podemski, 1997].

Также специального штамма, экпрессирующего фермент сайт-специфическую рекомбиназу фага лямбда, требует вектор Janus, созданный на основе одноцепочечного фага М13 серии тр и представляющий собой модифицированный вектор, несущий int ген фага лямбда [Burland et al., 1993]. Отличительной чертой этого вектора является возможность переориентации вставки in vivo, приводящая соответственно к упаковке в фаговые частицы разных цепей клонированного фрагмента ДНК. Произведенный авторами подсчет показал, что для завершения проекта секвенирования ДНК с помощью вектора Janus требуется значительно меньше усилий, чем при секвенировании случайных клонов или при осуществлении праймерной "прогулки".