Секвенирование по сэнгеру больших днк праймерной прогулкой

Определение "Секвенирование по сэнгеру больших днк праймерной прогулкой" в ЭБНБ

Секвенирование фрагментов ДНК

Усовершенствование химического синтеза олигонуклеотидов, сделавшее их более доступными, легло в основу стратегии секвенирования, названной подходом с использованием внутренних или прогрессивных праймеров, или праймерной "прогулкой" [Sanchez-Pescador, Urdea, 1984; Brenner, Shaw, 1985; Strauss et al., 1986]. Суть этого способа заключается в постепенном получении информации о нуклеотидной последовательности протяженного фрагмента ДНК, секвенируя вставку сначала с помощью первого праймера, затем при помощи второго и последующих, синтезированных на основе ставшей известной в первых раундах секвенирования последовательности нуклеотидов клонированного фрагмента ДНК (рис.). К преимуществу этой стратегии можно отнести ненужность получения субклонов исходного протяженного фрагмента ДНК. Однако существенным недостатком является некоторая задержка с получением информации об очередной "порции" ДНК, связанная со временем синтеза нового секвенирующего праймера. И все же главным недостатком является необходимость постоянного синтеза самих этих праймеров. Для удешевления всего проекта по секвенированию протяженного фрагмента ДНК очередной праймер необходимо подбирать на максимально возможном удалении от предыдущего, но обеспечивающем безошибочное "чтение" нуклеотидной последовательности, что зависит и от типа используемого прибора и от опыта самого экспериментатора и ряда других причин. Стратегия секвенирования ДНК праймерной "прогулкой" с использованием двух типов праймеров, один из которых предназначается для дальнейшего чтения секвенируемой матрицы, а второй праймер подбирается с таким расчетом, чтобы секвенировать эту же матрицу ДНК в обратном направлении, позволяет выявить возможные неточности в определении нуклеотидной последовательности [Voss et al., 1993]. Таким образом, первый тип праймеров рассчитан на получение новой информации, а второй выступает в качестве подтверждающего праймера.

Секвенирование участков ДНК

Одной из главных составляющих стоимости подобного проекта секвенирования ДНК являются сами праймеры. Причем даже самый малый масштаб синтеза олигонуклеотидов позволяет синтезировать такое количество олигонуклеотидов, которое в тысячи раз превышает применяемое в качестве затравки в реакциях секвенирования. Оставшийся праймер, как правило, больше нигде не используется, что крайне не экономно. Это обстоятельство заставляло искать какие-то новые варианты стратегии секвенирования ДНК праймерной "прогулкой". По этой причине на протяжении уже многих лет разрабатываются варианты использования или более коротких праймеров, или состоящих из нескольких коротких (5-7 нуклеотидов) модулей. Так, один из подходов заключается в существовании предсинтезированной библиотеки относительно коротких (8-12 звеньев) олигонуклеотидных праймеров, которые могли бы с успехом применяться в разных проектах секвенирования протяженных фрагментов ДНК [Studier, 1989; Siemieniak, Slightom, 1990; Burbelo, Iadaroia, 1994; Slightom et al., 1994]. В других работах говорится о библиотеке еще более коротких (4-7 нуклеотидов) блоков-модулей, которые в определенных условиях способны формировать полноценные 12-, 18- или даже большей длины олигонуклеотид-ные праймеры [Ажикина и др., 1993; Кнорре и др., 1996; Szybalski, 1990; Kieleczawa et al., 1992; Azhikina et al., 1993; Kotler et al., 1993; Kaczorowski, Szybalski, 1994, 1996; Dunn et al., 1995]. Еще один интересный подход к решению проблемы секвенирующих праймеров заключается в ферментативном дифференциальном удлинении короткого праймера с помощью неполного набора дезоксинуклеотид трифосфатов [Raja et al., 1997].

Амплификация участков ДНК, метод 1

Независимо от типа праймерных молекул, представляющих собой или единый олигонуклеотид, или состоящих из отдельных модулей, общая стратегия секвенирования ДНК праймерной "прогулкой", приведенная на рис., остается неизменной. Некоторое отличие реально осуществляемых проектов от того, что приведено на данной схеме, и направленное на ускорение выполнения проекта по определению нуклеотидной последовательности ДНК, заключается в одновременном секвенировании вставки с обоих концов клонированного фрагмента или даже еще с какого-либо произвольного места вставки, что позволяет накапливать данные соответственно в два или три раза быстрее (кратность ускорения зависит от исходного числа точек, с которых начинается секвенирование и праймеров к ним). При этом праймерами для секвенирования краев вставки обычно служат стандартные секвенирующие праймеры, комплементарные соответствующим участкам векторной молекулы.

Амплификация участков ДНК, метод 2

Так, была предложена стратегия секвенирования космидных клонов, заключающаяся в максимальном увеличении числа точек внутри вставки, которые могли бы служить начальными для секвенирования праймерной "прогулкой" [Siemieniak et al., 1991]. А так как последовательность клонированного фрагмента ДНК неизвестна, то и целенаправленный выбор секвенирующих праймеров невозможен. С этой целью осуществлялось построение рестриктазной карты клонированного фрагмента и секвенирование отдельных рестриктазных фрагментов химической деградацией по Максаму-Гилберту, поскольку этот метод не требует предварительного знания даже части нуклеотидной последовательности. Другой подход заключался в использовании для ферментативного секвенирования специального сплинкера [Kalisch et al., 1986] (подробно описанного ниже) или даже коротких олигонуклеотидных праймеров, отжигающихся на такой матрице достаточно непредсказуемо [Studier, 1989]. Таким образом, на первом этапе секвенирования шло накопление стартовых сведений о нуклеотидной последовательности отдельных участков клонированного в космиде протяженного фрагмента ДНК и уже затем начинался этап широкомасштабного секвенирования праймерной "прогулкой".

Стратегия секвенирования ДНК

Другой тип олигонуклеотидных молекул при осуществлении праймерной "прогулки" описан в статье Фу и соавт. [Fu et al., 1995]. Ими был применен одно/двуцепочечный праймер, формируемый путем отжига 23-членного и 18-членного олигонуклеотидов, что привело к образованию на одном из его 3'-концов 5 выступающих нуклеотидов. Авторы цитируемой статьи делают заключение, что предсинтезированная библиотека подобных праймеров будет меньше, чем состоящая из более привычных гексамеров, поскольку все возможные варианты 5 неспаренных нуклеотидов приведут к существованию всего 1024 (4⁵) таких олигонуклеотидов. Принцип же использования подобных праймеров заключается в образовании затравочного комплекса для ДНК-полимеразы путем их отжига на одноцепочечном участке фрагмента ДНК, образуемого подходящей рестрикционной эндонуклеазой (например ApaBI), и удерживаемых на одноцепочечной матрице ДНК также за счет стэкинг-взаимодействия.

Стратегия секвенирования фрагментов ДНК

В литературе описан способ определения нуклеотидной последовательности участка ДНК, прилегающего к тому, для которого последовательность уже известна с помощью ПЦР и специальной олиго-кассеты (рис.) [Rosenthal, Jones, 1990]. Для этого проводится расщепление секвенируемого протяженного фрагмента ДНК какой-либо гексануклеотидной рестрикционной эндонуклеазой. Затем следует этап лигирования полученных рестриктазных фрагментов с олиго-кассетой, представляющей собой двуцепочечный участок ДНК, состоящий из двух отожженных олигонуклеотидов, с соответствующим "липким" концом. В результате все рестриктазные фрагменты в смеси будут нести по своим концам подобную олиго-кассету. Далее в цитируемой работе авторы проводили 50 циклов линейной ПЦР с одним праймером, несущим биотинилированную метку и отжигающимся на участке ДНК с известной последовательностью. После удаления из реакционной смеси с помощью магнитных частиц со стрептавидином различных фрагментов ДНК, не несущих молекулы биотина, продукт линейной ПЦР амплифицировался уже экспоненциально при помощи этого же и второго праймеров, причем второй праймер отжигался на олиго-кассете. Таким образом, еще через 35 циклов появлялся двуцепочечный продукт ДНК, часть последовательности которого была известна, а другую часть предстояло определить. Такая схема последовательного определения все новых и новых участков ДНК может действовать и дальше и поэтому авторы назвали свой подход в нашем несколько вольном переводе "геномной прогулкой с олиго-кассетой".

Стратегия секвенирования рестриктазных фрагментов ДНК

Другим способом амплификации и последующего секвенирования неизвестных участков ДНК, прилегающих к известным, является подход с проведением ПЦР с пониженной температурой отжига (например, 40 °С вместо 55 °С) в первых циклах с тем, чтобы используемый праймер мог отжечься еще в других участках ДНК [Malo et al., 1994]. Более направленным подходом амплификации подобных участков ДНК является метод обращенной ПЦР, где места отжига праймеров на рестриктазном фрагменте ДНК расположены с таким расчетом, что синтез новых цепей как бы направлен в разные стороны, однако поскольку перед амплификацией производится с помощью Т4 ДНК-лигазы циркули-зация рестриктазных фрагментов, то это приведет в конечном итоге к наработке интересующего исследователей участка неизвестной ДНК [Ochman et al., 1988]. Аналогичный подход был предложен другими авторами, единственное отличие которого заключалось в еще одном этапе рестриктазного расщепления по какому-нибудь подходящему сайту в известном фрагменте ДНК, расположенном между местами отжига олигонуклеотидных праймеров [Triglia et al., 1988]. Таким образом, в образующемся линейном фрагменте ДНК происходила реориентация локализации неизвестных участков с краев внутрь (рис.). В литературе встречается описание ряда других подходов к амплифицированию неизвестных фрагментов ДНК, прилегающих к известным [Arnold, Hodgson, 1991; Parker et al., 1991; Jones, Winistorfer, 1992; Verhasselt et al., 1992; Jones, Winistorfer, 1993; Williamson, Rutherford, 1994; Devon et al., 1995; Dominguez, Lopez-Larrea, 1994; Siebert et al., 1995; Trueba, Johnson, 1996; Sterky et al., 1998; Weber et al., 1998].

Был предложен еще один весьма продуктивный метод секвенирования неизвестных участков геномной ДНК, заключающийся в нескольких циклах линейной амплификации с помощью биотинилированного праймера, отжигающегося на участке ДНК с известной нуклеотидной последовательностью с таким расчетом, что при его ферментативном удлинении рост новосинтезируемой цепи ДНК будет направлен в область с неизвестной последовательностью нуклеотидов, интересующую исследователя [Lagerstrom et al, 1991; Nguyen et al., 1998]. На следующем этапе проводится сорбция этих биотинилированных цепей ДНК на магнитных частицах со стрептавидином и удаление остальной ДНК. Затем с помощью короткого олигонуклеотидного праймера с произвольно выбранной последовательностью и исходного биотинилированного осуществляется второй этап ПЦР, проводимый уже в условиях экспоненциальной амплификации (рис.). Поскольку короткий произвольный праймер имеет достаточно высокую вероятность отжечься на неизвестном участке ДНК, то в результате 25-30 новых циклов будет наработан фрагмент или фрагменты ДНК, которые можно будет отобрать по размеру. Однако, если подобный эксперимент проводить не с изолированными линейными амплификатами, содержащими участок с известной нуклеотидной последовательностью, но и в присутствии всей, не удаленной основной массы тотальной ДНК, то количество амплифицированных случайных фрагментов ДНК будет чрезмерно большим за счет значительного числа мест отжига таких коротких праймеров, что или сильно затруднит, или сделает невозможным поиск среди них целевого фрагмента.

Весьма интересен подход к секвенированию протяженных фрагментов ДНК, названный авторами не праймерной "прогулкой", а "прогулкой фрагментов" ДНК [Okano, Kambara, 1996]. Назван он так, видимо, потому, что удлиняемые на одном из первых этапов олигонуклеотидные праймеры и используемые затем в качестве затравки на завершающем ввиду их большой длины трудно назвать праймерами. Главной особенностью этого подхода можно считать крайне малую библиотеку предсинтезированных олигонуклеотидных праймеров, состоящую всего из 16 вариантов — 5'-TTTTTlTlTlTlTlTGCGNN-3'. 15 нуклеотидов этих праймеров формируют общую часть и представляют собой блок из дезокситимидинов, далее следуют три нуклеотида, комплементарных сайту узнавания (или, вернее, тому, что от него остается после расщепления ДНК) какой-либо рестрикционной эндонуклеазы (в рассматриваемой статье GCG и HhaI) и служащих в качестве позиционирующих нуклеотидов. Оставшиеся два нуклеотида (NN) принадлежат к варьирующей части и представляют собой все 16 возможных вариантов динуклеотидов АА, AC, AG, AT, CA, СС и т.д.

На первом этапе клонированный фрагмент ДНК расщепляется соответствующей рестрикционной эндонуклеазой (здесь — HhaI), образующей 3'-выступающий конец. Далее с помощью терминальной нуклеотидтрансферазы к полученным рестриктазным фрагментам "пришивается" блок поли(дА). После денатурации ДНК и отжига сразу всех возможных 16 праймеров идет построение цепи ДНК, приводящее к удлинению некоторых праймеров. За счет довольно протяженной общей части этих праймеров (TTTTTTTTTTTTTTTGCG) все они "отожгутся" на поли(дА)-последовательности, причем позиционирующие нуклеотиды (GCG) заставят их сделать это вплотную к концу рестриктазного фрагмента ДНК. Однако удлинение праймеров будет возможно только в том случае, если два последних вариабельных нуклеотида (NN) окажутся комплементарными присутствующим в самой матрице ДНК (при использовании ДНК-полимеразы с отсутствующей или удаленной 3' → 5'-редактирующей активностью). Таким образом, на данном этапе происходит как некоторая селекция праймеров, так и их удлинение. На следующем этапе осуществляется непосредственно само секвенирование ДНК путем построения новых цепей ДНК в условиях терминирования дидезоксинуклеотид трифосфатами. Матрицами служат как повторно денатурированные фрагменты ДНК из предыдущей реакции удлинения праймера, так и вновь добавленный исходный клонированный фрагмент ДНК, не подвергнутый расщеплению рестрикционной эндонуклеазой (здесь - HhaI). В результате одновременно протекает две секвенирующие реакции. Одна из них использует выбранный какой-то конкретный 5'-TTTTTTTTTTTTTTTGCGNN-3' праймер, отжигающий на матрице в виде рестриктазного фрагмента ДНК, другая - удлиненный праймер, или, правильнее сказать, "фрагмент-праймер", отжигающийся уже своей удлиненной частью на нерасщепленном исходном фрагменте ДНК. Эта стадия проходит в режиме циклического секвенирования и в результате оказывается возможным "чтение" обоих продуктов секвенирующих реакций. Следует отметить, во-первых, некоторую конкуренцию "фрагмента-праймера" и комплементарной ему цепи рестриктазного фрагмента на этапе отжига перед секвенирующими реакциями, и, во-вторых, определенные сложности в выборе того или иного праймера из 16 возможных (описание данного процесса нами просто опущено). Из представленной (упрощенной) схемы на рис. можно оценить всю сложность и трудоемкость данного подхода. Однако этот метод возник не неожиданно и явился продолжением предыдущих работ этой группы. Ранее в модельном эксперименте с HindIII-фрагментами ДНК фага лямбда эти авторы продемонстрировали успешное применение данного подхода без построения поли(дА)-конца [Furuyama et al., 1994].

Стратегия секвенирования рестриктазных фрагментов ДНК, расщепленных ферментами, образующими 3'-выступающие концы, путем "пришивания" к последним поли(дА)блока, приведенная на рис., известна давно [Stallard et al., 1987]. В цитируемой работе для проведения терминирующих реакций рестриктазные фрагменты ДНК расщеплялись соответствующими ферментами (здесь - КрпI или PstI) и после присоединения к ним участка поли(дА) с помощью терминальной трансферазы расщеплялись другой подходящей рестрикционной эндо-нуклеазой, разделялись электрофорезом и элюировались из геля. 20-звенные праймеры, кроме 16 дТ-остатков, в качестве позиционирующих нуклеотидов содержали элементы сайтов узнавания GTAC и TGCA, использованных для расщепления ферментов КрпI или PstI соответственно. После отжига KpnI- или PstI-праймера на элюированной из геля и денатурированной матрице проводились терминирующие реакции и продукты разделялись секвенирующим гель-электрофорезом.

Другой разновидностью праймерной "прогулки" является стратегия секвенирования протяженных фрагментов ДНК ферментативным методом по Сэнгеру с помощью сплинкера - секвенирующего праймер-линкера (рис.). Одно из основных отличий этого способа секвенирования ДНК от подхода праймерной "прогулкой" заключается в довольно ограниченном числе олигонуклеотидных праймеров, необходимых для его осуществления. Было найдено весьма интересное решение по объединению в одной молекуле праймера и линкера, получившего название сплинкер (splinker - sequencing primer linker) [Kalisch et al., 1986]. Особенностью такого сплинкера было то, что его последовательность содержала внутренний участок гомологии, что при определенной температуре приводило к формированию вторичной структуры в виде "шпильки" с выступающим или тупым концами. За счет этих выступающих или тупых концов осуществлялось лигирование данного конкретного сплинкера с элюированным из геля рестриктазным фрагментом ДНК, имеющем аналогичные концы. Таким образом, основная последовательность самого сплинкера могла быть практически одинаковой и отличаться только своими концевыми нуклеотидами, выбор вариантов которых довольно ограничен.

Для осуществления этой стратегии секвенирования требуется некоторая предварительная подготовка как самого сплинкера, так и рестриктазного фрагмента ДНК. Для того чтобы сплинкер мог служить в качестве затравочной молекулы для элюированного из геля рестриктазного фрагмента, на его 5'-конец необходимо с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4 в присутствии АТФ добавить остаток фосфорной кислоты. А рестриктазный фрагмент ДНК, напротив, надо дефосфорилировать обраткой щелочной фосфатазой. В результате этих процедур после лигирования сплинкера с данным рестриктазным фрагментом, как можно видеть из рис., образуется "ник", приводящий после денатурации цепей ДНК к формированию затравки для синтеза новой комплементарной цепи ДНК в условиях терминации с дидезоксинуклеотидтрифосфатами. Перед нанесением продуктов терминирующих реакций на секвенирующий гель-электрофорез необходим этап их расщепления рестрикционной эндонуклеазой, сайт которой имеется в сплинкере, поскольку, как отмечалось выше, необходимым элементом сплинкера является наличие в его двуцепочечном участке доступного сайта узнавания относительно редкощепящей рестрикционной эндонуклеазы, расщепление которого позволяет удалить концевую петлю сплинкера. Такое расщепление обеспечивает образование гомогенного 5'-конца для смеси терминированных фрагментов ДНК. Следует отметить, что при этом способе секвенирования ДНК метка не может находиться на 5'-конце праймера и должна включаться в ходе проведения терминирующих реакций.

Еще ряд подходов, описываемых ниже, хотя и не принадлежат к классическим вариантам праймерной "прогулки", все же основаны на использовании олигонуклеотидных праймеров. Вторым важным условием их осуществления является применение ПЦР. Так, был предложен интересный способ получения однонаправленных делеционных вариантов клонированной вставки с помощью ПЦР и биотинилированного праймера [Yohda et al., 1995]. Амплифицированный с использованием фланкирующих его праймеров (один из которых нес биотинилированную метку) фрагмент ДНК был затем расщеплен тетрануклеотидной рестрикционной эндонуклеазой в условиях недорестрикции. Далее следовал этап лигирования полученных фрагментов со специальным линкером, в результате чего образовывалась смесь разнообразных фрагментов, среди которых присутствовали как ограниченные по обеим концам только линкерами, так и варианты с участием линкера и того или иного праймера. Добавление в реакционную смесь магнитных частиц, покрытых стрептавидином, позволяло сорбировать на них только ограниченные биотинилированным праймером, тогда как прочие исключались из дальнейшего обращения. В результате повторного этапа ПЦР с данным биотинилированным праймером и праймером, гомологичным линкеру, происходила амплификация однонаправленных делеционных вариантов вставки, после разделения гель-электрофорезом которых они становились пригодны для секвенирования. Несколько похожий метод, также основанный на частичном расщеплении амплификатов тетрануклеотидной рестрикционной эндонуклеазой в условиях недорестрикции, описывается в другой работе [Wright, 1992]. Главное отличие этого подхода состояло в неиспользовании магнитных частиц и биотинилированного праймера. Другими авторами аналогичное частичное расщепление фрагмента ДНК достигалось за счет произвольного включения во время ПЦР метилированных производных цитозина, что защищало фрагмент ДНК от действия ферментов, чувствительных к метилированию цитозиновых остатков [Wong et al., 1997].

Секвенирование ДНК с помощью произвольных праймеров стало возможным благодаря предложенному методу, названному авторами SWAPP (Sequencing With Arbitrary Primer Pairs) [Burt et al., 1994]. Однако подобный подход малопригоден для крупномасштабного секвенирования ДНК и может применяться лишь для определения нуклеотидных последовательностей произвольных фрагментов ДНК у близкородственных организмов с целью выявления полиморфизма каких-то их генов или прочих фрагментов ДНК. Главным условием для успешного осуществления этого метода является секвенирование амплификатов, ограниченных обязательно разными праймерами. Иначе в противном случае необходимо проводить деление цепей, что весьма трудоемко и сразу снижает ценность метода. Выявление амплификата, пригодного для секвенирования, проводится путем сравнения 3 электрофоретических картин результатов ПЦР, в которых использовались оба праймера вместе и поодиночке. Полосы, видимые только при совместном применении праймеров и совпадающие у разных образцов ДНК по размеру (что косвенно может свидетельствовать об их принадлежности к сходным участкам генома у близкородственных видов), элюировались из геля и брались для дальнейшего секвенирования с использованием в качестве затравки при проведении уже терминирующих реакций одного из амплификационных праймеров.

Неким вариантом секвенирования ДНК с помощью "прогулки" праймерами можно считать "мультипраймерное" секвенирование, где в качестве затравочных молекул служат обе цепи подходящих рестриктазных фрагментов ДНК вставки [Akiyama et al., 1992]. Поскольку построение комплементарных цепей ДНК в данной работе в условиях терминации осуществлялось в присутствии деазапроизводных дГТФ и дАТФ, то у авторов после завершения реакций появилась возможность удаления служащего праймером рестриктазного фрагмента за счет восстанавливаемого сайта используемой рестрикционной эндонуклеазы без опасения расщепить новосинтезированную цепь ДНК, несущую модифицированные нуклеотиды, что позволило увеличить число "читаемых" нуклеотидов.