Секвенирование по сэнгеру больших днк направленным поиском

Определение "Секвенирование по сэнгеру больших днк направленным поиском" в ЭБНБ

Получение однонаправленных субклонов ДНК, метод 1

При определении последовательности нуклеотидов протяженных фрагментов ДНК направленным подходом получение субклонов носит упорядоченный характер, иногда основанный на знании рестриктазной карты клонированного фрагмента ДНК. В связи с этим состыковка секвенированных фрагментов не представляет каких-либо сложностей, так как заранее известно, какое место вставки подвергается секвенированию. Уменьшается и общее число "прочитанных" нуклеотидов, что позволяет удешевить проект по секвенированию протяженного фрагмента ДНК.

Получение однонаправленных субклонов ДНК, метод 2

Наиболее оптимальным является получение в составе исходного вектора субклонов, различающихся размером делетированных участков вставки между сайтом какой-либо подходящей полилинкерной рестрикционной эндонуклеазы, предшествующим сайту клонирования (со стороны отжига секвенирующего праймера) и прогрессивно удаляющимися местами вставки. Однако большинство вариантов направленного подхода, предполагающего получение серии таких субклонов, укороченных с одного конца вставки, различаясь значительно при проведении делеционных процедур, требуют первого этапа рестриктазного картирования с целью или построения подробной рестриктазной карты секвенируемого фрагмента ДНК, или обнаружения подходящих рестрикционных эндонуклеаз, отсутствующих во вставке, которые могут быть затем использованы для получения необходимых субклонов.

Получение двунаправленных субклонов ДНК, метод 1

Описанный в предыдущем разделе метод получения делеционных субклонов с помощью ДНКазы I/Mn²⁺ в векторе pBR322 [Frischauf et al., 1980], на самом деле, мало чем отличается от подобных работ, ставящих своей целью получение субклонов для их последующего секвенирования ферментативным методом. Так, в данной статье было просто заявлено, что эти субклоны предназначены для секвенирования по Максаму-Гилберту. Но в то же время другое, более важное отличие заключается в том, что используемый в той работе вектор pBR322 не несет полилинкера и специального участка для отжига универсального праймера. Однако ввиду своей относительной простоты этот метод получения серии делеционных субклонов в составе вектора, несущего полилинкер, с целью их последующего секвенирования ферментативным методом с помощью ДНКазы I в присутствии Мп2+ применяется весьма часто [Hong, 1982, 1987; Laughon, Scott, 1984; Lin et al., 1985]. Некоторое усовершенствование в виде повторного этапа расщепления лигированных фрагментов ДНК дополнительной рестрикционной эндонуклеазой приводило к обогащению лигазной смеси рекомбинантными плазмидами, несущими делеционные варианты вставок [Lin et al., 1985]. Причиной этому было то, что сайт второй ре-стрикционной эндонуклеазы расположен между сайтом первой рестрикционной эндонуклеазы и местами разрыва цепи ДНК во вставке, произошедшими под действием ДНКазы. Как следствие, расщеплялись только восстановленные исходные варианты клона, несущие полноразмерную вставку и ненарушенный сайт узнавания для этого дополнительного фермента. Такое же повторное расщепление лигированных фрагментов ДНК, но уже рестрикционной эндонуклеазой, сайт узнавания которой был расположен с противоположной стороны вставки, приводило к тому, что линеаризованными оказывались конструкции, ДНКазное расщепление которых произошло не во вставке, а в противоположной части вектора относительно сайта расщепления первой рестрикционной эндонуклеазы, и не затронуло участки вектора, необходимые для его функционирования [Laughon, Scott, 1984]. Это не позволяет исключить из дальнейшего анализа исходный полноразмерный клон и дает лишь некоторое обогащение пула конечных субклонов с делеционными вариантами вставок за счет удаления конструкций с векторами, несущими незначительные делеции и сохранившими при этом возможность репликации. Что касается большинства вариантов расщепления вектора, произошедшими под действием ДНКазы в присутствии ионов марганца, то многие из них приводят к потери ими жизнеспособности и такие конструкции из дальнейших экспериментов исключаются.

Получение двунаправленных субклонов ДНК, метод 2

Данная стратегия с использованием ДНКазы I в сочетании с ПЦР привела к возможности нарабатывать матрицы для секвенирования прямо из трансформированных колоний, несущих делеционные варианты вставки, с последующим анализом амплификатов по размеру в агарозном геле [Burland, Kusukawa, 1997].

Получение однонаправленных делеционных вариантов, метод 1

Хотя при осуществлении этого подхода с ДНКазным расщеплением и не требуется построения детальной рестриктазной карты клонированного фрагмента ДНК, все же необходимо владеть информацией об отсутствии сайтов расщепления используемых полилинкерных рестрикционных эндонуклеаз во вставке, поскольку в противном случае результатом будет гетерогенная смесь, в которой будет чрезвычайно трудно разобраться.

Получение однонаправленных делеционных вариантов, метод 2

Был предложен также другой подход к получению делеционных субклонов с использованием ДНКазы I [Barnes, Bevan, 1983]. В этом случае обработка ДНКазой суперскрученной плазмидной ДНК проводилась в присутствии не ионов марганца, а интеркалирующего красителя бромистого этидия (рис.), что приводило не к разрыву обеих цепей ДНК, а только к формированию "ника". Следующий этап заключался в расширении с данного созданного "ника" одноцепочечного участка с помощью экзонуклеазы III. Далее в действие вступала нуклеаза Ва131, удалявшая одноцепочечный участок рекомбинантной плазмиды и приводившая, таким образом, к линеаризации вектора со вставкой. Затем с помощью Т4 ДНК-лигазы к образовавшимся тупым концам "пришивались" специальные ZsctfRI-линкеры и следовал этап расщепления данной конструкции этой рестрикционной эндонуклеазой. После завершающих этапов лигирования и трансформации проводился отбор фагов, содержащих нужные делеции вставки. Надо отметить, что особенностью используемых в данной работе одноцепочечных векторов серии mWB, сконструированных на основе дикого фага М13, была их способность давать голубое окрашивание на индикаторных чашках Петри (с добавлением x-gal и ИПТГ) даже в случае содержания вставки. Однако при нарушении участка lac-оператора, помещенного за вставку (что происходило в случае чрезмерного делетирования вставки, приводящего к полному ее удалению), окраска пропадала и, таким образом, подобные фаговые бляшки в дальнейший анализ уже можно было не брать. Другой особенностью всего этого комплексного подхода с участием многочисленных ферментов и названного авторами килосеквенированием, было электрофоретическое разделение не депротеинизированной фаговой ДНК, а жизнеспособных фаговых частиц, способных по завершению гель-электрофореза к трансфекции, что дало возможность авторам цитируемых работ значительно увеличить производительность анализа делеционных субклонов.

Получение однонаправленных делеций.

Также значительное количество различных ферментов для получения делеционных субклонов было использовано в работе других авторов (рис.) [Guo et al., 1983]. Здесь на первом этапе проводилась линеаризация вектора и вставки одной из полилинкерных рестрикционных эндонуклеаз HindIII. Затем под действием нуклеазы Ва131 или в другом варианте последовательным расщеплением линейной ДНК экзонуклеазой III и затем S1-нуклеазой, специфичной к однонитевой ДНК, происходило двунаправленное укорочение линеаризованного вектора и вставки. Разная продолжительность обработки приводила к появлению образцов с наборами фрагментов ДНК различающейся длины. Расщепление вторым полилинкерным ферментом, расположенным с другой стороны вставки, генерировало смесь фрагментов ДНК, часть из которых представляла собой однонаправленные делеционные варианты вставок. Лигирование этих фрагментов в новом векторе позволяло получить желаемый набор субклонов. Однако был необходим этап анализа полученных клонов, направленный на определение размера содержащейся в них вставки. Следует отметить сложность проведения всех этих последовательных процедур.

Получение однонаправленных делеционных субклонов.

Было сообщено об аналогичном использовании нуклеазы Ва131 для получения однонаправленных прогрессивных делеций клонированной вставки с последующим переклонированием набора по-разному укороченных вариантов вставки в одноцепочечном векторе M13mp7 [Poncz et al., 1982] и модифицированном М13 векторе тТМОЮ [Misra, 1985; Misra, 1987]. Причем в последнем случае автор не прибегал к весьма трудоемкой процедуре разделения гетерогенных фрагментов ДНК гель-электрофорезом. В литературе содержатся сведения о быстром несколько модифицированном методе выделении плазмидной ДНК, специально предназначенной для получения серии делеционных субклонов с помощью нуклеазы Ва131 [Sharrocks, Hornby, 1987].

Получение дискретных матриц ДНК

Все приведенные выше стратегии секвенирования ДНК предполагали получение однонаправленных делеционных вариантов клонированных фрагментов ДНК и поэтому весьма интересны немногочисленные работы по получению двунаправленных делеционных вариантов вставки [Breault et al., 1995; Ren et al., 1997]. В одной из них под действием нуклеазы Ва131 (или комбинацией экзонуклеазы III и нуклеазы золотистой фасоли) проводилось двунаправленное укорочение элюированного из геля клонированного фрагмента ДНК в направлении "снаружи → внутрь" (рис.) в течение нескольких дискретных промежутков времени [Ren et al., 1997]. После клонирования в подготовленном новом векторе серии укороченных подобным образом фрагментов ДНК появляется возможность секвенирования вставок в обеих ориентациях, как за счет противоположно направленных праймеров, так и за счет вероятности случайного клонирования данных фрагментов в любой ориентации.

Определение сиквенса фрагмента ДНК

Также двунаправленное укорочение вставок, но уже в направлении "изнутри → наружу" (рис.) было проведено с помощью нуклеазы Ва131 в другой работе [Breault et al., 1995]. К преимуществам данного подхода можно отнести то, что укорочение вставки осуществляется без ее элюции из геля и последующее субклонирование проводится в том же исходном векторе. Единственное требование заключается в наличии уникального сайта какой-либо рестрикционной эндонуклеазы, расположенного по возможности ближе к центру исходного клонированного фрагмента ДНК. Расщепление вектора со вставкой данным ферментом приводит к его линеаризации и образованию двух концов, принадлежащих клонированному фрагменту ДНК и доступных для гидролиза нуклеазой Ва131. За счет различного времени протекания реакции происходит соответственно разное укорочение фрагмента ДНК, что позволяет получить набор субклонов, полностью перекрывающих всю последовательность вставки. Некоторой особенностью получения субклонов и самого проведения этапа лигирования является то, что в образовавшуюся брешь между противоположными концами вставки встраивают синтетический участок ДНК небольшой протяженности, формируемый за счет отжига двух комплементарных олигонуклеотидных праймеров и имеющий тупые концы. Впоследствии обе цепи этого линкера служат, прежде всего, местами отжига этих же олигонуклеотидов, выступающих уже в роли секвенирующих праймеров, что позволяет секвенировать обе цепи клонированного фрагмента ДНК в противоположных направлениях. Другое предназначение данного линкера заключается в отборе с его помощью укороченных делеционных вариантов исходной вставки. Последнее становится возможным за счет того, что этот синтетический линкер содержит в своей последовательности сайт какой-нибудь редкощепящей рестрикционной эндонуклеазы и те клоны, плазмидная ДНК которых линеаризуется под действием этого фермента, отбираются для их последующего секвенирования, а клоны, расщепляемые первым ферментом, изначально присутствующим во вставке, представляют собой неделетированные варианты и должны отбрасываться. Некоторым недостатком этого метода, как считают отдельные авторы [Ren et al., 1997], является невозможность использования стандартных секвенирующих праймеров, однако, те же олигонуклеотиды, которые и образуют синтетический линкер, служат и секвенирующими праймерами, так что каких-либо дополнительных усилий по синтезу новых праймеров затрачивать не приходится. Другим недостатком, впрочем временным и легко преодолимым, является неизвестность ориентации линкера в каждом конкретном клоне, что приводит к необходимости определения принадлежности секвенированного участка ДНК к той или иной цепи клонированного фрагмента ДНК при его последующем сравнении и состыковке с другими секвенированными участками.

Дельта-рестрикционное клонирование

Описанные выше варианты направленной стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК основаны на особенностях действия используемых ферментов. Так, ДНКаза I в присутствии ионов марганца производит разрыв обеих цепей ДНК с образованием или тупых концов, или с небольшим количеством выступающих нуклеотидов, легко поддающихся репарации. Этот же фермент в присутствии интеркалирующего красителя бромистого этидия делает так называемые ники в виде одиночных разрывов одной цепи ДНК. Специфичная к однонитевой ДНК S1 нуклеаза применяется для разрыва второй цепи ДНК в месте образовавшегося "ника" или целого участка одноцепочечной ДНК, сформировавшегося после "расширения" "ника" с помощью экзонуклеазы III. Для этой же цели используют и другую нуклеазу Ва131, обладающую относительно слабой эндонуклеазной активностью, специфичной для однонитевой ДНК. (Более сильная экзонуклеазная активность этого фермента позволяет деградировать двуцепочечные участки ДНК). Еще один фермент - экзонуклеаза III, используемый вместе с другими ферментами (нуклеазами) в некоторых из упомянутых выше способах для удаления одной цепи ДНК, начиная с "ника" увеличивает в направлении 3' → 5' участок одноцепочечной ДНК.

Получения однонаправленных делеционных субклонов

Однако последний фермент нашел и самостоятельное весьма широкое применение в экспериментах по получению делеционных субклонов, пригодных для секвенирования ДНК (рис.). Были предложены различные варианты использования экзонуклеазы III для получения делеционных вариантов исходного субклона [Guo, Wu, 1982; Henikoff, 1984, 1987; Yanisch-Perron et al., 1985; Sorge, Blinderman, 1989; Li, Tucker, 1993; Zhu, Clark, 1995]. Общим для всех этих способов является то, что в качестве предварительного этапа необходимо построение рестриктазной карты клонированного фрагмента ДНК. Или точнее, на первом этапе предстоит выяснить отсутствие во вставке сайтов для полилинкерных рестрикционных эндонуклеаз, которые могли бы быть использованы для однонаправленного укорачивания фрагмента ДНК с помощью экзонуклазы III (рис.). Причем эти рестрикционные эндонуклеазы должны быть определенным образом ориентированы по отношению ко вставке и генерировать 3'-выступающий (один фермент) и 5'-выступающий или тупой конец (другой фермент). В противном случае при выявлении отсутствующих во вставке полилинкерных ферментов, образующих только 5'-выступающие концы, 3'-конец одного из них необходимо с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I защитить тиопроизводным соответствующего дНТФ от действия экзонуклеазы III [Putney et al., 1981]. Впрочем, далеко не все фрагменты ДНК с 3'-выступающими концами защищены от их расщепления экзонуклеазой III. Считается, что менее подвержены экзонуклеазной атаке этим ферментом фрагменты ДНК с 4 выступающими нуклеотидами на 3'-конце. Иной способ защиты одного конца линеаризованного вектора, несущего вставку от действия экзонуклеазы III, был предложен в работе других авторов [Johnson et al., 1990]. Так, ими на основе одноцепочечного вектора М13тр19 был сконструирован специальный вектор, который нес участок lac-оператора между полилинкером и сайтом отжига секвенирующего праймера. После расщепления подходящей полилинкерной рестрикционной эндонуклеазой в инкубационную смесь добавлялся белок lac-репрессор, прочно связывающийся с lac-оператором и защищающий таким образом, данный конец расщепленной репликативной формы вектора от экзонуклеазы III, действие которой как и при стандартном использовании [Henikoff, 1984] продолжалось в течение нескольких дискретных интервалов времени.

Стратегия секвенирования протяженной ДНК

Важное значение для этих и других стратегий секвенирования с помощью экзонуклеазы Ш приобретает получение достаточно дискретных наборов укороченных вставок, отбираемых по времени протекания реакции. Такие наборы должны характеризоваться минимальным разбросом внутри каждого варианта, поскольку в противном случае будет необходим анализ чрезмерного числа клонов и данный подход потеряет свою привлекательность. Так, в литературе содержатся различные рекомендации для уменьшения разброса, заключающиеся в варьировании температуры инкубации или концентрации NaCl в реакционной смеси [Tomb, Barcak, 1989].

Упрощенная стратегия секвенирования протяженной ДНК

Владение информацией об отсутствии сайтов узнавания отдельных рестрикционных эндонуклеаз в клонированном фрагменте ДНК позволяет приступить к получению его делеционных вариантов, где первым этапом является линеаризация вектора со вставкой двумя полилинкерными рестрикционными эндонуклеазами, причем сайты узнавания обоих ферментов должны быть расположены между местом отжига секвенирующего праймера и самой вставкой. Вторым условием является то, что расположенный ближе ко вставке фермент должен генерировать фрагменты ДНК с тупыми или 5'-выступающими концами, доступными для их расщепления экзонуклеазой III. Тогда как противоположный конец большого фрагмента ДНК не должен быть подвержен экзонуклеазной атаке. Во время второго этапа экзонуклеазного расщепления вставки в составе линеаризованного вектора через определенные промежутки времени из реакции удаляются аликвоты, что приводит к формированию гетерогенных фрагментов ДНК, у которых образовавшийся участок одноцепочечной ДНК имеет различную дискретную протяженность. Маленький фрагмент ДНК, приходящийся на участок полилинкера и ограниченный этими же использованными рестрикционными эндонуклеазами, настолько мал, что в процессе экзонуклеазной обработки одна его незащищенная цепь перестает существовать и он выключается из дальнейшего хода ферментативных реакций. Полученный в ходе предыдущего этапа набор дискретных фрагментов ДНК с выступающими одноцепочечными участками различной длины на одном из их 5'-концов обрабатывается или S1 нуклеазой, или нуклеазой из золотистой фасоли, или экзонуклеазой VII, специфичными к однонитевым участкам ДНК. В результате этой реакции, а также затупления концов с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I (его экзонуклеазной активности) образуются полностью двуцепочечные участки ДНК, имеющие разную протяженность делетированной вставки и пригодные для лигирования и последующей трансформации бактериальных клеток.

Несмотря на свою кажущуюся привлекательность и определенное удобство получения однонаправленных делеционных субклонов для секвенирования протяженных фрагментов ДНК, метод с использованием экзонуклеазы III все же весьма трудоемок. Определенные неудачи могут подстерегать экспериментатора при использовании в его работе с плазмидной ДНК, содержащей "ники", что приведет к непредсказуемому расщеплению и вектора и вставки, поскольку экзонуклеаза Ш способна к удалению одной цепи ДНК с таких "ников". Поэтому для проведения подобных экспериментов настоятельно рекомендуется использовать суперскрученную форму плазмид и, желательно, очищенную в градиенте плотности хлористого цезия [Henikoff, 1987]. В то же время, другими авторами в результате клонирования ПЦР-продуктов специально создавались "ники" за счет использования одного фосфорилированного праймера, а другого с отсутствием фосфатной группы на 5'-конце, что позволяло затем с помощью экзонуклеазы III и некоторых других ферментов получать набор по-разному делегированных субклонов [Kitabatake, Inokuchi, 1993].

Также была предложена оригинальная стратегия получения делеционных вариантов субклонов, основанная на применении все той же экзонуклеазы III [Henikoff, 1990]. Суть этой стратегии заключается в образовании сначала двуцепочечной структуры из одноцепочечного фага М13 или ему подобного и уже затем создании делеций. Так, на первом этапе проводится отжиг олигонуклеотидного праймера, расположенного таким образом, чтобы ДНК-полимеразой при удлинении праймера в первую очередь была скопирована сама векторная последовательность. Построение цепи ДНК осуществляется с помощью ДНК-полимеразы фага Т4, поскольку этот фермент характеризуется высокой скоростью полимеризации, не несет 5' → 3'-экзонуклеазной активности и не вызывает смещение цепей как некоторые другие ДНК-полимеразы. В результате образуется двуцепочечная молекула ДНК, несущая один "ник" между 5'-концом праймера и 3'-концом вновь синтезированной цепи ДНК. Далее в действие вступает экзонуклеаза III, работающая в обратном направлении и расширяющая "ник" до весьма протяженных участков одноцепочечной ДНК. Отбор аликвот данной реакции по времени расщепления приводит к формированию некоторого пула молекул с одноцепочечными участками различной протяженности. После удаления образовавшихся одноцепочечных участков S1 нуклеазой, репарации концов и их лигирования проводится трансформация компетентных клеток E.coli полученными конструкциями. Таким образом, как можно видеть из рис., в результате всех этих процедур об разуется набор рекомбинантных клонов, несущих по разному делетированные вставки. К значительному преимуществу данной стратегии можно отнести ее независимость от наличия или отсутствия сайтов определенных рестрикционных эндонуклеаз, в отличие от большинства других подходов, служащих для получения укороченных вариантов вставки с помощью экзонуклеазы III [Guo, Wu, 1982; Henikoff, 1984; Yanisch-Perron et al., 1985]. Но и недостатки также достаточно серьезные. Пожалуй, главный недостаток заключается в том, что полученные делеционные конструкции после их трансформации и выращивания в виде одноцепочечной фаговой ДНК нельзя секвенировать с помощью универсального праймера. Вернее, секвенировать можно, но при этом будет секвенироваться не подвергнутый делениям участок вставки, расположенный сразу за вектором, поскольку при выращивании того же фага или фагмиды, в которой изначально был клонирован фрагмент ДНК, будет упаковываться та же цепь. Некоторое решение проблемы заключается или в выделении двуцепочечной формы и ее последующем секвенировании, или в использовании специальных фагмид семейства pKUN, имеющих два несколько отличающихся ориджина фаговой репликации, позволяющих нарабатывать ту или иную цепь ДНК в ответ на их инфекцию соответствующими хелперными фагами [Konings et al., 1987].

Другие авторы сообщили об успешном получении подобной серии субклонов в фаговом векторе М13, где однонаправленное укорочение вставок осуществлялось благодаря 3' → 5'-экзонуклеазной активности Т4 ДНК-полимеразы [Dale et al., 1985]. Впоследствии этот подход был несколько модифицирован и позволил упростить процедуру заключительного лигирования делеционных вариантов вставки с одноцепочечным вектором [Milavetz, 1992]. Схема последовательно протекающих ферментативных реакций при создании делеционных конструкций вставки данным способом выглядит следующим образом (рис.). На первом этапе происходит отжиг специального олигонуклеотидного праймера 5,-CGACGGCCAGTGCCAAGCTTXXXX-3', гомологичного участку векторной молекулы (в рассматриваемом примере М13mp18), непосредственно прилегающему к полилинкеру и включающему в свой состав сайт узнавания крайней в данном полилинкере рестрикционной эндонуклеазы HindIII (подчеркнуто) и пять вариабельных нуклеотидов, которые могут быть любыми. Таким образом, данный олигонуклеотид представляет собой набор из 1024 всех возможных вариантов. После его отжига на одноцепочечной матрице ДНК образуется двуцепочечный участок с сайтом узнавания фермента HindIII. Чтобы исключить теоретическую вероятность расщепления одноцепочечной последовательности вставки данной рестрикционной эндонуклеазой (как известно, многие ферменты, хотя и с низкой эффективностью, способны расщеплять одноцепочечные молекулы ДНК) в реакционную смесь добавлялся SSB-белок, связывающийся с одноцепочечной ДНК и защищающий ее от расщепления. В результате такой защиты отпала необходимость в предварительном рестриктазном картировании вставки на предмет отсутствия в ней сайта(ов) данного фермента. После линеаризации по небольшому двуцепочечному участку рестрикционной эндонуклеазой HindIII одноцепочечной ДНК вектора и вставки, в реакционную среду вносили фермент ДНК-полимеразу фага Т4, которая в отсутствие дНТФ проявляет 3' → 5'-экзонуклеазную активность. Инкубация с этим ферментом продолжалась разные промежутки времени (от 5 до 30 мин) с отбором аликвот протекающей реакции. В результате ферментативного действия Т4 ДНК-полимеразы (ее экзонуклеазной активности) происходило как полное исчезновение небольшого двуцепочечного участка за счет расщепления остатков праймера, начиная с его 3'-конца, так и образование по-разному укороченных фрагментов вставки. После инактивации Т4 ДНК-полимеразы в реакционную смесь добавлялась новая порция указанного выше олигонуклеотидного праймера (названного автором "лигамер") и фермент Т4 ДНК-лигаза. На этой стадии происходил повторный отжиг части данного праймера, гомологичной векторной последовательности с вектором и отжиг какого-либо подходящего варианта (из 1024 возможных) со случайными концами вставки, образованными под действием Т4 ДНК-полимеразы и их лигирование. Лигированная одно/двуцепочечная ДНК использовалась для трансформации компетентных клеток E.coli.

Ранее был предложен имеющий много общего с описанными выше методами подход к получению делеционных субклонов в одноцепочечном векторе, основанный на построении с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I комплементарной цепи участков вставки, имеющих разную протяженность [Burton et al., 1988]. В цитируемой работе осуществлялся отжиг олигонуклеотидного праймера, в результате ферментативного удлинения которого происходило увеличение двуцепочечного участка вставки, причем производимый по времени отбор аликвот данной реакции обеспечивал получение их разной протяженности (рис.). Далее остающийся недостроенным одноцепочечный участок вставки и самого вектора удалялся нуклеазой S1. Затем с помощью подходящей рестрикционной эндонуклеазы, сайт которой находился в полилинкере поблизости от места клонирования вставки, "вырезались" делетированные варианты вставки. Их дальнейшее лигирование с заранее приготовленным вектором проводилось с таким расчетом, что происходила реориентация вставки, позволяющая секвенировать фрагменты ДНК со стороны делеций, давая, таким образом, возможность получить перекрывающиеся участки секвенируемой последовательности ДНК.

Интересный метод для создания одноцепочечных матриц с разной протяженностью одноцепочечного участка при секвенировании крупных фрагментов ДНК, не требующий нового этапа клонирования, заключался в линеаризации вектора со вставкой подходящей рестрикционной эндонуклеазой и последующей обработкой обоих концов с помощью экзонуклеазы III [Guo, Wu, 1982]. В этом случае знание рестриктазной карты также являлось необходимым условием, поскольку на первом этапе желательно использовать полилинкерный фермент, отсутствующий во вставке, тогда как после завершения экзонуклеазной обработки, которая обычно длится различные промежутки времени, необходимо проводить расщепление уже самой вставки рестрикционными эндонуклеазами, сайты которых предварительно картированы. Другой особенностью этого способа является ненужность секвенирующего праймера, поскольку в качестве затравки выступает остающийся после экзонуклеазной обработки участок двуцепочечной ДНК. Так, на первом этапе проводится расщепление вектора со вставкой. Затем следует обработка экзонуклеазой III в течение дискретных промежутков времени, приводящая к образованию целого спектра одно/двуцепочечных фрагментов ДНК. Следующий этап состоит в проведении непосредственно терминирующих реакций с дНТФ и соответствующими ддНТФ. Формирование необходимого для проведения секвенирующего электрофореза общего конца для каждого дискретного класса вновь синтезированных фрагментов ДНК осуществляется выбранными ранее рестрикционными эндонуклеазами, сайты которых локализованы во вставке в различных местах. Главной трудностью этого подхода можно считать подбор условий (времени) расщепления ДНК экзонуклеазой III и совмещение мест расщепления рестрикционными эндонуклеазами, чьи сайты расположены во вставке с целью получения набора гетерогенных по 3'-концам и гомогенных по 5'-концу секвенируемых фрагментов ДНК определенного размера, позволяющего осуществить их эффективное разделение с помощью гель-электрофореза.

В результате одновременного электрофоретического разделения продуктов двух секвенирующих реакций, образовавшихся при синтезе новых цепей ДНК, на противоположных концах линеаризованной матрицы со вставкой, возможность "читать" последовательность нуклеотидов вставки существует из-за значительной разницы в размерах построенных цепей, что предопределено выбором для расщепления подходящей рестрикционной эндонуклеазы. Так, при использовании фермента Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I, имеющего низкую процессивность, максимальный размер получаемых фрагментов при проведении терминирующих реакций обычно не превышает 350-500 нуклеотидов, а поскольку новосинтезированная цепь ДНК со стороны вектора за счет асимметричного расщепления второй рестрикционной эндонуклеазой имеет гораздо большую протяженность, то при проведении гель-электрофореза терминированные меченые фрагменты, принадлежащие участку вектора, будут расположены в верхней части геля и не будут, таким образом, интерферировать с секвенируемой областью вставки, что можно видеть из схемы, приведенной на рис.

Способ получения однонаправленных делеционных вариантов исходной вставки, названный авторами ExoMeth [Sorge, Blinderman, 1989; Sorge, Huse, 1994], несколько напоминает предыдущий вариант получения одноцепочечных матриц ДНК для их секвенирования [Guo, Wu, 1982]. Общее у них то, что нет необходимости в использовании специальных олигонуклеотидных праймеров, поскольку остающиеся двуцепочечные участки молекулы ДНК способны инициировать построение комплементарной цепи ДНК ДНК-полимеразой. Первые этапы подготовки матриц ДНК этим способом, включая расщепление двумя подходящими рестрикционными эндонуклеазами и однонаправленное удаление цепи ДНК под действием экзонуклеазы III, совпадают с таковыми при стандартном варианте использования экзонуклеазы III [Henikoff, 1984; Yanisch-Perron et al., 1985; Henikoff, 1987]. Главная особенность рассматриваемого способа (рис. 8.16) заключается в том, что в процессе проведения терминирующих реакций вместо дЦТФ в реакционной смеси присутствует 5-метил-дЦТФ. Таким образом, вновь синтезированная цепь ДНК получается метилированной, что имеет важное значение при ее последующем расщеплении рестрикционными эндонуклеазами, чувствительными к метилированию цитозина. В результате использования в условиях недорестрикции какой-нибудь подобной частощепящей рестрикционной эндонуклеазы образуется смесь терминированных дидезоксинуклеотидами фрагментов, общим 5'-концом для которых будут служить сайты расщепления этого фермента. А поскольку для одного и того же образца экзонуклеазная реакция длилась различные дискретные промежутки времени, то при этом образовывались соответствующие наборы терминированных фрагментов ДНК. И для каждого такого набора будет иметься свой общий 5'-конец, совпадающий с ближайшим сайтом используемой рестрикционной эндонуклеазы, что позволит провести их электрофоретическое разделение и "прочитать" последовательность нуклеотидов.

Пожалуй, стоит отдельно упомянуть одну работу [Li, Tucker, 1993], в которой авторы предложили метод секвенирования протяженных фрагментов ДНК с помощью экзонуклеазы III, названный ими "экзоквене" (exoquence). Данный метод очень сильно напоминает описанную выше ExoMeth стратегию [Sorge, Blinderman, 1989], где затравочными молекулами служат остающиеся двуцепочечные участки ДНК, но в отличие от нее не требует применения весьма дорогого модифицированного 5-метил дЦТФ. Однако предложенная авторами схема такого секвенирования ДНК вызывает некоторое недоверие в возможности получения набора вновь синтезированных молекул ДНК, имеющих уникальный 5'-конец, поскольку для достижения поставленной цели требуется проведение экзонуклеазной обработки в условиях, не дающих большого разброса по протяженности удаленного участка одной цепи ДНК, а также удачное расположение сайтов рестрикционных эндонуклеаз во вставке, которые используют в этом методе для образования гомогенных 5'-концов секвенируемых молекул ДНК после проведения терминирующих реакций. Авторы проанализировали эффективность работы экзонуклеазы III в зависимости от температуры инкубации, стараясь достичь минимального разброса по длине укороченного участка. Однако, на наш взгляд, для осуществления этого подхода необходимо полномасштабное рестриктазное картирование вставки с помощью большого числа редкощепящих рестрикционных эндонуклеаз для выявления наиболее подходящих при формировании гомогенного 5'-конца у терминированных фрагментов ДНК. Тогда как авторы цитируемой работы сообщают о большом числе использованных частощепящих тетрануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз, что в принципе невозможно, поскольку это неминуемо приведет к расщеплению и оставшегося нетронутым двуцепочечного фрагмента ДНК вставки (что не страшно, так как он остается немеченным и не будет виден на заключительном радиоавтографе) и, главным образом, участка ДНК с новосинтезированной в условиях терминации цепью, которая у них не защищена метилированием цитозина, как в ExoMeth стратегии [Sorge, Blinderman, 1989; Sorge, Huse, 1994]. Таким образом, вероятность возникновения гетерогенных по 5'-концу секвенируемых фрагментов ДНК очень высока, что вызовет наложение полос ДНК из разных генераций, произведенных действием частощепящей рестрикционной эндонуклеазы, и не позволит провести однозначное "чтение" нуклеотидной последовательности какого-либо фрагмента.

В связи с увеличением числа обнаруженных рестрикционных эндонуклеаз II типа, имеющих различные сайты узнавания, а также с созданием векторов с различными полилинкерами и даже суперполилинкерами, как, например, в фагмиде pSL301 [Brosius, 1989], рестриктазное картирование вставки стало проводиться с использованием, как правило, гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз, в первую очередь имеющихся в полилинкере используемого вектора или же отсутствующих во всей последовательности вектора вообще. Выявление таких ферментов (как присутствующих, так и тех, сайты которых отсутствовали во вставке) сделало возможным на основе этой же рекомбинант-ной плазмиды провести клонирование II порядка или как его еще называют - дельта-рестрикционное клонирование и за счет этого достаточно просто получить серию укороченных вариантов вставки [Ansorge et al, 1996]. Подобная стратегия уже упоминалась выше, поскольку также применима и для метода секвенирования ДНК химической деградацией, хотя с наибольшей эффективностью она используется все же при ферментативном секвенировании ДНК.

Из схематического представления такого способа получения нужных клонов, показанного на рис., видно, что дельта-рестрикционное клонирование позволяет удалять из вставки фрагменты ДНК разного размера и за счет этого получать серию однонаправленных делеционных (со стороны места для отжига праймера) субклонов, в отдельных случаях полностью перекрывающую всю длину вставки. Следует отметить, что большее число сайтов удобных рестрикционных эндонуклеаз в полилинкере и одновременно уменьшенное число сайтов других гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз в остальной последовательности вектора заметно увеличивало возможности этого способа получения необходимых субклонов для завершения проекта по секвенированию ДНК.

Так, идеальными вариантами являются случаи нахождения во вставке сайтов полилинкерных рестрикционных эндонуклеаз (или тех, что образуют фрагменты ДНК с совместимыми с ними концами при условии отсутствия сайтов расщепления этих ферментов в самом векторе), поскольку в этом случае образуются одинаковые концы, принадлежащие как полилинкеру, так и делетированной вставке. Чуть менее удобным вариантом можно считать образование после расщепления полилинкера и вставки разными ферментами фрагментов ДНК с тупыми концами из-за худшей эффективности лигирования последних по сравнению с липкими концами. Еще менее удобными являются случаи несовпадения образуемых под действием соответствующих ферментов концов фрагментов ДНК, что приводит к необходимости проведения дополнительных ферментативных этапов, чтобы сделать их совместимыми между собой. Другое неудобство заключается в том, что почти все полилинкерные рестрикционные эндонуклеазы являются ферментами с гексануклеотидными участками узнавания, что делает вероятность нахождения таких сайтов во вставке не очень большой, поскольку теоретическая частота встречаемости подобных сайтов в произвольной последовательности ДНК составляет один гексануклеотидный сайт на 4096 пн. Таким образом, в отдельных случаях не удается получить необходимый набор субклонов, позволяющий "прочитать" всю нуклеотидную последовательность клонированного фрагмента ДНК, что приводит к образованию иногда протяженных брешей. Использование же более частощепящих ферментов сопряжено с разрушением самого вектора, так как в нем также содержатся множественные сайты расщепления таких частощепящих рестрикционных эндонуклеаз. Следовательно, чтобы получить необходимый набор субклонов, полностью перекрывающий всю последовательность протяженного фрагмента ДНК, нужно для однонаправленного делеционного укорочения вставки использовать частощепящие рестрикционные эндонуклеазы, не допуская при этом разрушения самого вектора. Подобная стратегия, названная нами тетра/окта стратегия секвенирования, стала возможной благодаря созданию специального вектора и будет рассмотрена чуть ниже. А сейчас, видимо, стоит уделить определенное внимание подходу к получению однонаправленных делеционных субклонов, имеющему нечто общее с дельта-рестрикционным клонированием и с тетра/окта стратегией. Этим общим является получение прогрессивных однонаправленных делеций вставки, а также использование частощепящей тетрануклеотидной рестрикционной эндонуклеазы для получения необходимых субклонов в исходном векторе.

Так, интересным способом определения нуклеотидной последовательности протяженных фрагментов ДНК является один из вариантов направленного подхода с использованием рестрикционной эндонуклеазы ВатШ имеющей гексануклеотидный сайт узнавания GVGATCC, и рестрикционной эндонуклеазы Sau3AI с тетрануклеотидным сайтом узнавания VGATC и генерирующих пригодные для лигирования друг с другом выступающие концы [Lee, Lee, 1988]. Данный способ, не получивший широкого распространения ввиду ряда ограничений, о которых будет сказано ниже, основан на использовании подхода с частичным расщеплением вектора и вставки рестрикционной эндонуклеазой Sau3Al (рис.). При осуществлении этого способа секвенирования протяженных фрагментов ДНК также необходим предварительный этап, во время которого проводится рестриктазное картирование с целью выявления полилинкерных рестрикционных эндонуклеаз, отсутствующих во вставке. Более того, ключевым моментом является необходимость отсутствия в клонированном фрагменте ДНК сайтов узнавания для рестрикционной эндонуклеазы BamIII, поскольку в противном случае данный подход становится невозможным. Хотя, справедливости ради, следует отметить возможность использования других пар гексанук-леотидных и тетрануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз, как например, BglII (AVGATCT) и та же Sau3AI, SphI (GCATGVC) и NlaIII (CATGV) и др.

Первый этап данного метода заключается в линеаризации вектора, несущего вставку, рестрикционной эндонуклеазой ВатIII. Следующим этапом является расщепление и вектора и вставки в условиях недорестрикции частощепящим ферментом Sau3AI. Так как частота встречаемости какой-либо четверки нуклеотидов довольно высока и приходится в среднем по одному подобному участку на каждые 256 пн, то в любых протяженных вставках теоретически также должно быть несколько сайтов этой тетрануклеотидной рестрикционной эндонуклеазы. Поскольку в используемом авторами векторе на основе фага М13 имеется 6 сайтов узнавания для рестрикционной эндонуклеазы Sau3AI, то в результате неполного расщепления образуется набор различных фрагментов, включающих в свой состав укороченные варианты вставки и полноразмерный вектор, но обязательно будут присутствовать и варианты с полной вставкой и укороченным вектором, равно как и различные формы и с укороченными вставкой и вектором одновременно. Во время следующего этапа лигирования Т4 ДНК-лигазой происходит рециркулизация данных рестриктазных фрагментов и образуются, в том числе, искомые варианты с полноразмерным вектором и укороченными вставками. Следует отметить, что при инфекции штамма E.coli вариантами с укороченным вектором, приводящими к нарушению его нормального функционирования, фаговые бляшки на бактериальном газоне не образуются. В то же время существует высокая вероятность восстановления исходного рекомбинантного клона с полноразмерной вставкой, поскольку расщепление вектора со вставкой рестрикционной эндонуклеазой Sau3AI проводится в условиях сильной недорестрикции (из-за опасения необратимо разрушить вектор у большей части клонов), в результате чего многие вставки не успевают подвергнуться расщеплению. Для увеличения выхода искомых укороченных вариантов вставки применяют после лигирования еще один этап расщепления одной из полилинкерных гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз, отсутствующих во вставке, причем расположение сайта узнавания используемого для этой цели фермента относительно сайта клонирования и сайта рестрикционной эндонуклеазы ВатIII должно быть определенным образом ориентировано, в результате чего восстановившиеся и сохранившиеся исходные рекомбинантные конструкции линеаризуются, а, как известно, частота трансформации компетентных клеток E.coli линейными молекулами во много раз ниже, чем кольцевыми. Существенным недостатком данного метода является обязательный предварительный этап рестриктазного картирования, имеющий целью выявить, главным образом, отсутствие во вставке сайтов узнавания фермента BamIII, а кроме этого - выяснение отсутствия во вставке сайтов других полилинкерных рестрикционных эндонуклеаз для возможности их последующего использования. Причем с увеличением протяженности вставки вероятность нахождения таких ферментов (и в том числе вероятность отсутствия во вставке сайтов расщепления рестрикционной эндонуклеазы BamIII) пропорционально уменьшается.

Весьма похожая работа по получению однонаправленных делеционных субклонов в фаговом векторе М13 с помощью частичного расщепления вектора и вставки частощепящими рестрикционными эндонуклеазами после первого этапа линеаризации вектора уникальной гексануклеотидной рестрикционной эндонуклеазой была проведена чуть позже другими авторами [Lamperti, Villa-Komaroff, 1990]. Пожалуй, незначительные отличия данной работы от предыдущей состояли как в дополнительном этапе в виде теста на присутствие места отжига секвенирующего праймера в полученных делеционных субклонах, так и в отсутствии повторного расщепления лигированных конструкций. Поскольку сам вектор, как и вставка, также подвергался расщеплению частощепящими ферментами, это приводило к образованию нежизнеспособных форм, однако, как справедливо отмечают авторы, не исключены случаи возникновения небольших делеций, не влияющих на жизнеспособность фага. В связи с этим данный тест на сохранность места отжига праймера, проводимый путем отжига праймера и ферментативного включения радиоактивного дНТФ с последующим контролем продуктов реакции с помощью радиоактивного счетчика, выглядит вполне логичным. Введение этого этапа не снимало желательности повторного расщепления лигированных конструкций, поскольку они направлены на достижение разных целей. Так, повторное расщепление определенной полилинкерной рестрикционной эндонуклеазой продуктов лигазной реакции рассчитано на обогащение получаемых субклонов именно делеционными вариантами вставки и его не проведение может привести к высокому содержанию среди конечных субклонов вариантов с исходной неукороченной вставкой. Следует отметить, что несмотря на сильное сходство этих двух работ, авторы последней [Lamperti, Villa-Komaroff, 1990] в своем изложении не упоминали работу своих предшественников [Lee Y.-M., Lee S.-C, 1988].

Здесь же можно упомянуть работу еще одних авторов, посвященную получению однонаправленных делеционных субклонов секвенируемой вставки путем ее недорасщепления [Abath, Holder, 1995]. Однако серьезным ограничением предложенного ими варианта являлось то, что для частичного расщепления вставки использовался фермент с гексануклеотидным участком узнавания, а, как уже отмечалось выше, частота встречаемости таких сайтов для подобных экспериментов недостаточна и вероятность получения в этом случае полностью перекрывающихся субклонов крайне низка. Более того, принципиальным моментом является то, что исследователю должно быть заранее известно о наличии в секвенируемой вставке нескольких сайтов конкретного используемого фермента.

Почти все рассмотренные выше стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК в составе фаговых, плазмидных или фагмидных векторов направленного подхода требуют в той или иной степени предварительного этапа рестриктазного картирования вставки с целью выявления отсутствия в ней сайтов узнавания полилинкерных гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз. Причем, чем больше размер вставки, тем больше вероятность, что такие сайты во вставке все же присутствуют и, таким образом, соответствующие им рестрикционные эндонуклеазы не могут быть использованы для получения однонаправленных делеционных субклонов.

Ликвидация предварительного этапа - рестриктазного картирования вставки возможна за счет использования для расщепления вектора (в участке полилинкера) рестрикционными эндонуклеазами не с гекса-, -а октануклеотидными участками узнавания. Теоретическая частота встречаемости последних составляет один сайт на 65536 пн, против одного сайта на 4096 пн для гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз. Приведенные частоты встречаемости сайтов октануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз рассчитаны для ДНК с равным соотношением GC- и АТ-пар, но поскольку содержание GC-nap в геномах различных организмов варьирует в широких пределах, то, следовательно, частоты встречаемости участков узнавания для подобных ферментов с GC- или АТ-богатыми сайтами узнавания в таких AT- или GC-богатых ДНК будут заметно различаться. Так, для ДНК даже с 60%-ным составом GC-nap будет теоретически приходиться по одному участку АТТТАААТ, узнаваемому октануклеотидной рестрикционной эндонуклеазой SwaI, на каждые 390625 пн. Такая же редкая частота встречаемости будет характерна и для рестрикционной эндонуклеазы SrfI с октануклеотидным сайтом узнавания GCCCGGGC в ДНК с 60% АТ-пар. Для ДНК с 70% AT- или GC-nap теоретически частоты встречаемости будут уже составлять один сайт на почти 4 мпн (3901844 пн) для рестрикционных эндонуклеаз SrfI и SwaI соответственно. Что касается ДНК с приблизительно равным соотношением AT- и GC-nap, для которых теоретическая частота встречаемости этих сайтов такова, что существует вероятность присутствия одного такого участка на 65536 пн, то это, по крайней мере, в 6-7 или большее число раз превышает длину вставок, поскольку размер клонированного фрагмента ДНК в векторах данного типа редко может достигать 10 тпн. Таким образом, благодаря наличию в полилинкере специально сконструированного фагмидного вектора двух сайтов узнавания для редкощепящих октануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз SwaI или ее изошизомера Smil (АТТТАААТ) и SrfI (GCCCGGGC) появляется возможность использовать их для линеаризации вектора со вставкой, не проводя предварительного широкомасштабного рестриктазного картирования вставки. (Относительно редкие случаи наличия сайтов данных ферментов в предназначенном для секвенирования клонированном фрагменте ДНК и возможные последствия этого достаточно легко преодолимы.)

Во избежание недоразумения считаем важным уточнить, что обычно под GC-составом ДНК какого-то организма понимается соотношение нуклеотидов в обеих цепях ДНК, тогда как при анализе нуклеотидных последовательностей обычно рассматривается только одна цепь ДНК (РНК-подобная, для тех случаев, когда это известно). Так, если какая-либо ДНК содержит 50% GC-nap, то это не означает, что в одной цепи ДНК обязательно будет находиться по 25% аденина, тимидина, гуанина и цитидина, хотя это и возможно. Теоретически может оказаться так, что, скажем, аденины и цитидины будут находиться преимущественно в одной цепи, а гуанины и тимины - в другой. При этом общее содержание AT- и GC-nap для организма остается неизменным, но частота встречаемости сайтов рестрикционных эндонуклеаз будет весьма далекой от той, как если бы все нуклеотиды были распределены по длине одной цепочки ДНК весьма равномерно. Конечно, чем крупнее исследуемый фрагмент ДНК, тем более равномерно в среднем (теоретически) должны быть распределены в нем все характерные для данного организма, которому принадлежит участок ДНК, нуклеотиды, тогда как на ограниченных отрезках ДНК могут быть заметные отклонения, вызванные, например, большими блоками повторов с "простой" последовательностью.

Стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК в составе фагмидного вектора путем получения субклонов II порядка с использованием гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз, как уже отмечалось выше, достаточно просты по исполнению, но учитывая весьма редкую встречаемость их сайтов (теоретически один сайт на 4096 пн), часто бывает невозможно получить необходимый набор делеционных вариантов, позволяющих при секвенировании определить полную нуклеотидную последовательность всей вставки без промежутков. Решением проблемы могло бы быть использование для этой цели частощепящих рестрикционных эндонуклеаз с тетрануклеотидными сайтами узнавания (теоретическая частота встречаемости которых составляет 1 сайт на 256 пн) в условиях недорестрикции. Однако, использование подобных ферментов для этой цели практически невозможно из-за присутствия множества сайтов этих рестрикционных эндонуклеаз в самой последовательности обычных фаговых, плазмидных или фаг-мидных векторов, что неминуемо приведет к их разрушению.

Большинства всех этих недостатков лишена новая прогрессивная стратегия секвенирования протяженных фрагментов ДНК на основе специально сконструированного вектора [Чемерис и др., 1996]. Сущность данной тетра/окта стратегии секвенирования заключается в получении серии субклонов с однонаправленными делеционными вариантами вставки, покрывающими всю ее длину, с использованием специализированного фагмидного вектора, в котором отсутствуют сайты расщепления для одной или нескольких рестрикционных эндонуклеаз с тетрануклеотидными сайтами узнавания и одновременно наличием в полилинкере этого вектора сайтов расщепления для одной или нескольких рестрикционных эндонуклеаз с октануклеотидными сайтами узнавания, путем последовательного расщепления вектора, несущего вставку, одной из этих полилинкерных октануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз и затем уже расщепления вставки в составе линеаризованного вектора в условиях недорестрикции тетрануклеотидной рестрикционной эндонуклеазой, сайт расщепления которой отсутствует в векторной последовательности.

Схематично способ определения нуклеотидной последовательности протяженных фрагментов ДНК в составе фагмидного вектораpSequoiaT12 с помощью тетра/окта стратегии секвенирования, включая этап повторного расщепления той же октануклеотидной рестрикционной эндонуклеазой, приведен на рис., где "В", "R", "S" - сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI, RsaI и SrfI или SwaI соответственно; "V" - вектор, "V + Г - вектор с полной вставкой, изображенной в виде затемненной части кольца; "1", "2" и "3" - вектор с вариантами укороченной вставки; fp - место отжига праймера.

На I этапе вектор, несущий вставку, расщепляется одной из октануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз, т.е. проводится его линеаризация. На II этапе осуществляется уже расщепление непосредственно самой вставки в составе линеаризованного вектора тетрануклеотидным ферментом RsaI в условиях недорестрикции, в результате чего получаются все возможные варианты укорочения вставки. Различные RsaI-фрагменты клонированного фрагмента ДНК без векторной последовательности автоматически исключаются из дальнейшего обращения во время этапа трансформации и для упрощения схемы не показаны. III этап - лигирование продуктов рестрикции и недорестрикции Т4 ДНК-лигазой, в результате которого происходит рециркулизация линеаризованного вектора с различными делеционными вариантами вставки и, в том числе, восстановление исходной рекомбинантной плазмиды с полноразмерной вставкой. В последнем случае восстанавливается сайт октануклеотидной рестрикционной эндонуклеазы, использовавшейся для первоначального расщепления, что очень важно для проведения следующего этапа. Необходимо отметить возможность случайного лигирования отдельных RsaI-фрагментов (на схеме не приведены) и данного вектора, несущего варианты вставки, приводящего к неправильному порядку их расположения, не совпадающему с таковыми в исходном клонированном фрагменте ДНК и их последующего клонирования. Однако вероятность этого довольно низка и, как будет показано ниже, не приведет к ошибке при воссоздании полной нуклеотидной последовательности всей вставки. На IV этапе проводится повторное расщепление вектора, лигированного с вариантами вставки, той же октануклеотидной рестрикционной эндонуклеазой, использовавшейся ранее для линеаризации, с целью обогащения выхода клонов с укороченными вставками, поскольку эффективность трансформации линеаризованных форм плазмиды значительно ниже по сравнению с кольцевыми формами, а восстановленная исходная плазмида с неукороченным вариантом вставки в этом случае расщепится и превратится в линейную форму. На V этапе осуществляется стандартная трансформация лигазной/рестриктазной смесью компетентных клеток E.coli. Следующий, VI этап, необходим для отбора вариантов, наиболее оптимально покрывающих всю длину вставки, путем анализа размера плазмид в различных субклонах. С этой целью проводятся стандартные процедуры по микровыделению рекомбинантных плазмидных ДНК и анализу их размера гель-электрофорезом (на схеме показаны только суперскрученные формы плазмид). VII-XII этапы посвящены приготовлению матриц для проведения терминирующих реакций, проведению самих этих реакций, разделению продуктов реакций в секвенирующем геле, радиоавтографии и чтению нуклеотидной последовательности. На приведенной схеме "прочитанной" нуклеотидной последовательности всей вставки, сайты клонирования (как довольно удобные и часто используемые) по рестрикционной эндонуклеазе ВатН (GGATCC) показаны курсивом, сайты RsaI (GTAC), являющиеся местами состыковки различных субклонов и служащие в качестве удобных ориентиров, подчеркнуты. Потенциальные ошибочные субклоны с неправильным порядком и/или ориентацией RsaI-фрагментов, которые могут возникнуть при случайном лигировании, на стадии чтения и состыковки нуклеотидной последовательности будут выявлены за счет несовпадения участков перекрытия и исключены. Для разделения продуктов терминирующих реакций, проведенных с одноцепочечными ДНК-матрицами тех субклонов, которые наиболее оптимально покрывают всю длину вставки, их наносят на секвенирующий гель в порядке уменьшения размера вставок, начиная с исходного клона с полноразмерной вставкой. Нанесение образцов в соседние дорожки геля внутри каждой матрицы в виде четверок реакций GTAC (совпадающих с сайтом узнавания рестрикционной эндонуклеазы RsaI, с помощью которой и получались данные субклоны) образует на радиоавтографе в местах нахождения этой последовательности хорошо заметные ровные ступеньки из полос на соседних дорожках GTAC, служащие удобным ориентиром, значительно упрощающим состыковку нуклеотидных последовательностей разных субклонов при восстановлении полной последовательности клонированного фрагмента ДНК.

С использованием тетра/окта стратегии секвенирования возможно также упрощенное получение серии субклонов, несущих укороченные вставки требуемого размера, без трудоемкого анализа многочисленных колоний с целью определения размера вставок. Для этого проводится полупрепаративный электрофорез вектора со вставкой, последовательно расщепленных октануклеотидной и тетрануклеотидной эндонуклеазами рестрикции в условиях полной и частичной рестрикции соответственно, и полосы, содержащие вектор с различными укороченными вариантами вставки, вырезают из геля. Каждый образец ДНК, элюированный из этих кусочков геля, лигируют отдельно и отдельно трансформируют. Таким образом, при трансформации компетентных клеток E.coli на той или иной чашке Петри будут присутствовать колонии, несущие плазмиды с определенным, требуемым размером вставки. Отпадает также необходимость в проведении этапа повторного расщепления октануклеотидной рестрикционной эндонуклеазой, поскольку лигирование и трансформация компетентных клеток E.coli вектором, несущим исходную полноразмерную вставку, исключены. Практически отсутствует и вероятность случайного лигирования отдельных RsaI-фрагментов клонированного фрагмента ДНК и вектора, несущего различные варианты вставки.

Подобное получение серии субклонов с требуемыми размерами укороченной вставки при раздельном лигировании элюированных из геля образцов ДНК и их независимой трансформации возможно только с использованием вектора, в нуклеотидной последовательности которого отсутствуют сайты расщепления для тетрануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз, каковым и является фагмидный вектор pSequoiaT12, поскольку при наличии в векторной последовательности сайтов узнавания фермента, используемого для недорестрикции, образуется чрезмерно сложная картина электрофоретического разделения, в которой выбрать необходимые полосы не представляется возможным.

Данный упрощенный подход способа определения нуклеотидной последовательности протяженных фрагментов ДНК в виде схемы приведен на рис., где "S + R" - продукты рестрикции/недорестрикции исходной рекомбинантной плазмиды октануклеотидной (SrfI или SwaI) и тетрануклеотиднои (RsaI) рестрикционными эндонуклеазами; "М" -ДНК фага лямбда, расщепленная ферментом BstEII, а все остальные обозначения как в рис.

На I и II этапах, как и в описанном выше способе, вектор, несущий вставку, расщепляется одной из октануклеотидных эндонуклеаз рестрикции и затем осуществляется уже расщепление непосредственно самой вставки в составе линеаризованного вектора тетрануклеотиднои рестрикционной эндонуклеазой RsaI в условиях недорестрикции, в результате чего получаются все возможные варианты укорочения вставки. На III этапе проводится полупрепаративное разделение продуктов рестрикции/недорестрикции гель-электрофорезом с целью определить и элюировать из геля фрагменты ДНК, содержащие вектор с требуемыми размерами вставок, наиболее оптимально покрывающих всю ее длину. На данной схеме такие полосы ДНК, отобранные для дальнейшего лигирования, трансформации и секвенирования, заключены в рамку. В качестве маркерных молекул используются ДНК фага лямбда, расщепленная рестрикционной эндонуклеазой BstEII, а также линеаризованные формы вектора и исходного рекомбинантного клона с полноразмерной вставкой. Различные RsaI-фрагменты клонированного фрагмента ДНК, не превышающие по размеру сам вектор, не мешают анализу рестрикционных фрагментов ДНК и для упрощения схемы не показаны. Что касается присутствия RsaI-фрагментов, не подвергнувшихся полному расщеплению и превышающих по размеру вектор (в случае если общая длина вставки имеет большую протяженность, чем вектор), то они всегда будут представлены в меньшем количестве, чем полосы, содержащие вектор и укороченные варианты вставок. Разная степень интенсивности полос позволяет выбрать необходимые полосы и поэтому RsaI-фрагменты крупного размера также не приведены на схеме для ее упрощения. Раздельное лигирование элюированных из геля фрагментов ДНК ДНК-лигазой фага Т4, осуществляемое на IV этапе, приводит к рециркулизации линеаризованного вектора с различными делеционными вариантами вставки. Необходимо отметить отсутствие среди трансформантов исходной рекомбинантной плазмиды с полноразмерной вставкой, а также практически полное исключение случайного лигирования отдельных RsaI-фрагментов и их последующего клонирования. На V этапе проводится стандартная трансформация данными лигазными смесями компетентных клеток Е. coli. VI-XI этапы посвящены приготовлению матриц для проведения терминирующих реакций, проведению самих этих реакций, разделению продуктов реакций в секвенирующем геле, радиоавтографии и чтению нуклеотидной последовательности аналогично VII-XII этапам на рис.

Наиболее важными преимуществами определения нуклеотидной последовательности протяженных фрагментов ДНК с помощью тетра/окта стратегии секвенирования являются:

1. не требуется проведения предварительного этапа рестриктазного картирования с целью выявления полилинкерных рестрикционных эндонуклеаз, сайты расщепления которых отсутствуют во вставке;
2. использование вектора, в котором:
   1. отсутствуют сайты расщепления для некоторых рестрикционных эндонуклеаз с тетрануклеотидными участками узнавания;
   2. в полилинкере присутствуют участки узнавания для октануклеотидных эндонуклеаз рестрикции с АТ-богатым (SwaI, ATTTAAAT)и GC-богатым (SrfI, GCCCGGGC) участками узнавания;
   3. концы, генерируемые этими октануклеотидными и тетрануклеотидной рестрикционной эндонуклеазой, пригодны для лигирования друг с другом;
3. линеаризация данного вектора, несущего вставку одной из полилинкерных октануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз, частота встречаемости которых обычно в 15-200 раз реже, чем для гексануклеотидных;
4. расщепление протяженной вставки тетрануклеотидной рестрикционной эндонуклеазой RsaI, отсутствующей в векторной последовательности, в условиях недорестрикции без опасения расщепить вектор;
5. возможность повторного расщепления рециркулизованной формы восстановленной исходной рекомбинантной плазмиды той же октануклеотидной рестрикционной эндонуклеазой с целью обогащения выхода искомых укороченных вариантов вставки;
6. возможность быстрого получения субклонов, несущих однонаправленные укороченные варианты вставок требуемого размера и наиболее оптимально покрывающих всю длину клонированного фрагмента ДНК без этапа повторного расщепления циркулизованных форм вектора, несущего вставки октануклеотидной эндонуклеазой рестрикции, не прибегая к весьма трудоемкому этапу анализа размера вставок у большого числа колоний;
7. отсутствие необходимости сложной состыковки прочитанной последовательности с использованием специальных компьютерных программ при разделении в одном секвенирующем геле последовательно друг за другом продуктов терминирующих реакций, проведенных с субклонами с однонаправленными делеционными вариантами вставки и нанесенных на гель в порядке уменьшения размера вставки, начиная с исходного клона с полноразмерной вставкой, поскольку сайты расщепления вставки тетрануклеотидной рестрикционной эндонуклеазой (в случае RsaI - GTAC) служат удобными ориентирами (при условии нанесения каждого образца в соседние дорожки геля в соответствующем порядке, для RsaI - GTAC), помогающими также исключить вероятность ошибки при определении участков состыковки нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК.