Секвенирование по сэнгеру больших днк случайным поиском

Определение "Секвенирование по сэнгеру больших днк случайным поиском" в ЭБНБ

Стратегия получения субклонов фрагмента ДНК, метод 1

Что касается ферментативного секвенирования ДНК по Сэнгеру, то этот метод изменился за эти годы весьма сильно и разработанные стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК оказали заметное влияние на его общую производительность. Большинство существующих стратегий секвенирования протяженных фрагментов ДНК ферментативным методом основаны на получении серии субклонов. Различают два главных подхода к их получению, один из которых считается случайным, а другой направленным. В основе стратегий случайного подхода лежит произвольная фрагментация ранее клонированного фрагмента ДНК и дальнейшее получение субклонов с небольшими вставками в другом векторе (а не в исходном), причем их размер, как правило, позволяет осуществить определение нуклеотидной последовательности всего субклонированного фрагмента за один эксперимент без дополнительного этапа субклонирования. Стратегии направленного подхода предполагают создание серии субклонов обычно в составе исходного вектора, различающихся размером делетированных участков вставки между сайтом какой-либо подходящей полилинкерной рестрикционной эндонуклеазы, предшествующим сайту клонирования (со стороны отжига секвенирующего праймера), и прогрессивно удаляющимися местами вставки. И тот и другой подходы имеют как свои преимущества, так и недостатки, к рассмотрению которых мы и перейдем.

Стратегия получения субклонов фрагмента ДНК, метод 2

Отсутствие необходимости предварительного рестриктазного картирования протяженной вставки является важным преимуществом стратегий случайного подхода и позволяет экономить много времени и усилий на данном этапе, а также и на этапе лигирования, который проводится только один раз со всем множеством получаемых мелких фрагментов ДНК. Поскольку для получения серии подобных субклонов фрагментация ДНК осуществляется произвольным образом или с помощью ферментов, или физическим воздействием, то знания рестриктазной карты совершенно не требуется. Однако клонирование таких случайных фрагментов приводило, подчас, к многократному секвенированию одних и тех же участков ДНК, что имело, впрочем, некоторое положительное значение, увеличивая достоверность нуклеотидной последовательности ДНК ввиду ее многократного "прочтения", да еще и в обоих направлениях. В то же время отдельные фрагменты иногда никак не удавалось субклонировать и секвенировать.

Стратегия получения субклонов фрагмента ДНК, метод 3

Проведенные статистические расчеты показали, что для определения нуклеотидной последовательности всего крупного фрагмента ДНК случайным подходом необходимо секвенировать в 7-10 раз больше нуклеотидов, чем сам секвенируемый фрагмент. Причем, чем крупнее фрагмент ДНК, тем труднее завершить проект по его секвенированию этим подходом, поскольку вероятность получения требуемых субклонов на заключительной стадии в этом случае заметно снижается. Поэтому в литературе содержались рекомендации по первоначальному получению двух, трех или большего числа субклонов I порядка (в зависимости от общей протяженности исходного фрагмента ДНК) с использованием подходящих рестрикционных эндонуклеаз. Размер таких субклонов I порядка, как правило, не должен был превышать 5 тпн и их расположение друг относительно друга в исходном полноразмерном фрагменте ДНК должно быть известно. Таким образом, при подобном секвенировании крупных фрагментов ДНК случайным подходом уже прослеживался некий элемент направленности. Следует также отметить, что в целях экономии на определенном этапе выполнения проекта по секвенированию протяженного фрагмента ДНК рекомендовалось проведение реакций только с одним терминирующим нуклеотидом ddT, так называемый Т-трэкинг, позволяющий выявить уже ранее секвенированные матрицы сопоставлением полос в Т-дорожке и исключить, таким образом, их повторное секвенирование. С этой целью была разработана специальная компьютерная программа TRACTOR, позволяющая выявлять такие клоны и уменьшать за счет этого объем экспериментальной работы на заключительном этапе секвенирования [Niemi, Mantsala, 1994].

Обязательным важным этапом при определении нуклеотидной последовательности ДНК случайным подходом было последующее правильное расположение относительно друг друга секвенированных участков ДНК. Большое количество беспорядочно секвенируемых образцов, которые несли цепи ДНК в противоположных ориентациях, потребовало разработки специальных компьютерных программ, позволяющих осуществлять такую стыковку как в ручном, так и в автоматическом режимах. Следует отметить, что особенно серьезные трудности возникали при состыковке секвенированных фрагментов ДНК, содержащих многочисленные повторяющиеся элементы.

Система для секвенирования ДНК методом "дробовика", основанная на разработанном одноцепочечном векторе, несущем удобный полилинкер, вызвала к жизни способ получения небольших фрагментов ДНК для их последующего клонирования с помощью частощепящих рестрикционных эндонуклеаз с тетрануклеотидными сайтами узнавания (рис.) [Messing et al., 1981]. Преимуществом этого способа можно считать относительную легкость этапа лигирования при условии использования рестрикционных эндонуклеаз, образующих фрагменты ДНК с "липкими" концами. Что касается лигирования рестрикционных фрагментов ДНК, несущих тупые концы, то и в этом случае не требовались дополнительные этапы, предшествующие лигированию, в отличие от других методов получения коротких фрагментов ДНК, рассматриваемых ниже. Главный недостаток данного подхода заключается в том, что сайты используемых рестрикционных эндонуклеаз могут быть расположены не очень равномерно и, таким образом, существует вероятность получить какой-нибудь субклон, несущий вставку довольно крупного размера, не позволяющую осуществить ее "прочтение" за один эксперимент.

Другой подход к получению случайных фрагментов ДНК для их последующего клонирования был осуществлен при помощи расщепления вставки ДНКазой I в присутствии ионов Mn²⁺ (рис.) [Anderson, 1981]. Известно, что при таких условиях ДНКаза образует разрывы обеих цепей ДНК, причем эти разрывы обычно расположены недалеко друг от друга. Применение этого фермента позволяло получать действительно случайный набор фрагментов ДНК, практически независящий от нуклеотидной последовательности. Таким образом, проведя подбор условий расщепления ДНКазой/Mn²⁺, а затем, расфракционировав полученные фрагменты по размеру или ультрацентрифугированием в сахарозном градиенте или же гель-электрофорезом, можно было получить достаточно однородные фрагменты ДНК для создания на их основе субклонов. Однако концы таких фрагментов не были пригодны к лигированию, и требовалось их затупление, осуществляемое обычно с помощью Т4 ДНК-полимеразы.

Приведенные выше способы получения мелких фрагментов ДНК осуществляются с помощью ферментов, однако применение для этой цели физического воздействия в виде ультразвуковой обработки раствора ДНК или его распыления через соответствующее сопло с помощью газообразного азота (небулизация) также возможны [Deininger, 1983а, b; Pan et al., 1994]. Механическое воздействие на ДНК крупного размера, приводящее к ее фрагментации, возможно путем продавлива-ния раствора ДНК через тонкую иглу G-30 с диаметром отверстия 0,16 мм [Ansorge et al., 1986]. Для этой же цели применялся специально изготовленный миниатюрный Французский пресс [Schriefer etal., 1990].

Обработка фрагмента ДНК ультразвуком с целью его фрагментации, применяемая, пожалуй, чаще других воздействий, лишь незначительно зависит от особенностей его нуклеотидной последовательности, хотя и считается, что АТ-богатые участки ДНК расщепляются немного чаще, чем GC-богатые. Размер получаемых под действием ультразвуковой обработки фрагментов ДНК зависит от продолжительности озвучивания, его амплитуды. Полученные таким образом фрагменты ДНК также нуждаются в репарации своих концов, протекающей достаточно эффективно, с целью их затупления и пригодности для клонирования в специально приготовленном векторе (рис.). Эффективное секвенирование субклонированных фрагментов предполагает предварительное обогащение пула "озвученных" молекул ДНК путем ультрацентрифугирования или гель-электрофореза.

Следует отметить, что все описанные выше способы получения субклонов требуют предварительного выделения вставки, так как в противном случае часть субклонов будет нести фрагменты не вставки, а вектора. При этом существует возможность поиска среди массы полученных субклонов тех, которые содержат нужные вставки путем молекулярной гибридизации колоний с исходной меченой вставкой. Однако из-за своей трудоемкости этот этап крайне нежелателен и проще изначально работать с очищенной вставкой. Впрочем, при фрагментации ДНК-космид, несущих крупную вставку, сильно превышающую по размеру сам вектор, на первом этапе секвенирования этим можно и пренебречь.

Некоторая опасность при получении субклонов кроется в возможном лигировании между собой мелких фрагментов ДНК в произвольном, неправильном порядке (т.е. не в том, в каком они находятся в исходном фрагменте) и уже в виде такого составного фрагмента лигировании его с вектором. Результатом этого будет неверно определенная последовательность ДНК и дополнительные трудности в состыковке фрагментов при составлении полной нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК. Исключить это можно путем де-фосфорилирования 5'-концов фрагментированной ДНК щелочной фосфатазой перед этапом лигирования, что, впрочем, приведет к общему снижению эффективности этого процесса. Другая возможность эффективного субклонирования фрагментов ДНК заключается в применении специальных адапторов. Так, в одной работе [Povinelli, Gibbs, 1993], ввиду низкой эффективности лигирования тупых концов при объединении вектора и вставки, было предложено осуществление на первом этапе лигирования вставки и адаптора, происходящего также по тупым концам, но с большей эффективностью. Далее следовал этап лигирования с вектором, предварительно расщепленным подходящей рестрикционной эндонуклеазой, генерирующей 4 выступающих на 5'-конце нуклеотида, один из которых достраивался с помощью соответствующего дНТФ и Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы, что приводило к неспособности вектора к самолигированию (замыканию в кольцо без участия вставки). За счет того, что и вектор, и вставка, точнее, ее адаптор, несли на своих "липких" концах по три комплементарных нуклеотида, достигалась высокая эффективность их лигирования между собой и, как следствие, высокий выход рекомбинантных клонов, превышающий 95%. В своей следующей работе этими авторами был заметно усовершенствован подход к получению подобных субклонов с помощью адапторной технологии [Andersson et al., 1994]. Более высокая эффективность субклонирования с уменьшенным фоном достигалась путем использования адаптора с 11 выступающими нуклеотидами и специального вектора, подготовленного с помощью урацил-ДНК-гликозилазы. В данном случае объединение вектора и вставки происходило без участия Т4 ДНК-лигазы простым отжигом 11 выступающих комплементарных нуклеотидов на концах вектора и вставки. Метод "двойных адапторов" с выступающими 12 нуклеотидами позволил этим же авторам настолько усовершенствовать процедуру субклонирования, что рекомбинантных клонов в результате трансформации оказывалось более 99% [Andersson et al., 1996].

Другой особенностью получения субклонов исследуемой вставки является то, что во избежание так называемого "краевого" эффекта, при котором будут теряться фрагменты ДНК, приходящиеся на концы вставки, желательно фрагментацию клонированной ДНК осуществлять в виде ее не линейного варианта, а кольцевого или конкатамеризованного, получаемого с помощью лигирования Т4 ДНК-лигазой. На этом же принципе получения конкатамерных конструкций основано крупно-масштабное секвенирование кДНКовых клонов [Andersson et al., 1997]. Данный подход, названный авторами как CCS (concatenation cDNA sequencing), заключается в произвольном объединении с помощью ДНК-лигазы фага Т4 кДНКовых вставок в единый блок, его произвольной дефрагментации и субклонировании в векторах на основе фага М13. Далее проводится стандартное секвенирование и затем, на этапе анализа "прочитанных" нуклеотидных последовательностей, осуществляется восстановление исходных фрагментов кДНК, где в качестве неких маркеров служат сайты рестрикционных эндонуклеаз, характерных для того или иного клона. Как указывают авторы, преимуществом этого подхода является одновременное секвенирование сразу большого числа кДНК-фрагментов, позволяющее повысить эффективность этой процедуры. В своей другой работе они сообщают об успешном секвенировании с помощью CCS-стратегии 100 тпн, принадлежащих 69 индивидуальным кДНКовым клонам, причем точность определения заключительной нуклеотидной последовательности соответствовала установленному стандарту 99,99% [Yu et al., 1997].

Подходы к получению субфрагментов ДНК под действием физических факторов или обработкой ДНКазой, независящие от последовательности нуклеотидов, были несколько предпочтительнее, чем формирование библиотеки субклонов с помощью частощепящих рестрикционных эндонуклеаз с тетрануклеотидными сайтами узнавания. Однако, открытие новых ферментов с различными специфичностями действия спустя много лет привело к тому, что этот подход с использованием рестрикционных эндонуклеаз получил новое развитие. Так, благодаря обнаруженной сверхчастощепящей рестрикционнои эндонуклеазе CviJI, узнающей последовательность RGCY, теоретически встречающуюся через каждые 64 нуклеотида, появилась возможность получать необходимые субклоны для секвенирования протяженного фрагмента ДНК, которые бы полностью перекрывали всю вставку без промежутков [Fitzgerald et al., 1992]. В этой работе было также отмечено, что в определенных условиях (в присутствии 1 мМ АТФ и 20 мМ ДТТ) фермент несколько меняет свою специфичность и способен расщеплять не только сайты RGCY, но и RGCR и YGCY, однако не способен расщеплять YGCR. Таким образом, реальная частота встречаемости сайтов этой рестрикционнои эндонуклеазы в особых условиях расщепления увеличивается до каждых 16 нуклеотидов. Хотя другими авторами при использовании этой же рестрикционной эндонуклеазы CviJI с целью получения субклонов клонированного ранее в космиде протяженного фрагмента ДНК было отмечено, во-первых, что расщепление ДНК данным ферментом осуществлялось только по нормальному сайту расщепления RGCY, и, во-вторых, среди 43 тпн (37,8 тпн вставки и 5,2 тпн вектора) был выявлен участок около 1 тпн, не содержащий ни одного такого сайта [Gingrich et al., 1996]. Впрочем, еще одно преимущество данного подхода к получению субклонов по сравнению с упоминавшимися выше вариантами фрагментации протяженного фрагмента ДНК обработкой ультразвуком или другими физическими воздействиями, а также ДНКазой в присутствии ионов марганца, заключается в образовании рестриктазных CviJI-фрагментов с тупыми концами, поскольку данный фермент производит разрыв цепи ДНК между центральными гуанином и цитозином. Тогда как прочие способы фрагментации приводят, главным образом, к образованию участков ДНК не с тупыми концами и поэтому необходимы дополнительные ферментативные этапы по затуплению концов этих коротких фрагментов ДНК.

Нельзя обойти молчанием относительно недавнюю работу французских авторов, посвященную сравнительному анализу эффективности выполнения двух проектов секвенирования фрагмента ДНК протяженностью около 6,2 тпн разными способами [Demolis et al., 1995]. Получение субклонов при выполнении первого проекта осуществлялось с помощью рестрикционных эндонуклеаз с тетрануклеотидными сайтами узнавания AluI, Sau3AI и TaqI. Второй проект был выполнен с использованием ДНКазы I/Mn²⁺. Так, в цитируемой работе убедительно показана более высокая производительность подхода, где требуемые субклоны были получены при помощи произвольного расщепления секвенируемого фрагмента ДНК ДНКазой в присутствии ионов марганца.

Недавно для получения субклонов для секвенирования было предложено использовать рестрикционные эндонуклеазы IIS-типа, причем генерирующие фрагменты ДНК с 5 выступающими нуклеотидами на 5'-конце [Rena, Houslay, 1998]. По мнению авторов, данные уникальные последовательности, образуемые этими 5 нуклеотидами, позволят осуществить правильную состыковку секвенируемых субклонов, не прибегая к построению детальной рестриктазной карты всего фрагмента ДНК.

Часто по завершению цикла экспериментов по секвенированию ДНК случайным подходом и после компьютерной состыковки "прочитанных" последовательностей оказывается, что субклоны для отдельных участков среди прочих были не секвенированы. Выявление в созданной клонотеке таких субклонов стандартным способом требует много времени и усилий, поэтому был предложен вариант, в котором с помощью агарозного гель-электрофореза в каждой дорожке разделялось одновременно 10 образцов [Hong, 1988]. Причем, как такового, выделения ДНК не проводилось и электрофоретическому разделению подвергались аликвоты супернатанта после выращивания одноцепочечных фагов с добавлением равного объема буфера для нанесения, содержащего 1%-ный додецилсульфат натрия. Метод очень простой и относительно быстрый, но качество разделения, впрочем, оставляет желать лучшего.

Другой подход к завершению определения нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК заключается в целенаправленном субклонировании конкретного участка исходного клона. Достичь этого можно, построив с помощью компьютера рестриктазную карту секвенированных областей вставки, основываясь на ставшей уже известной последовательности нуклеотидов части секвенируемого фрагмента ДНК, что, возможно, позволит определить необходимые рестрикционные эндонуклеазы для субклонирования нужного фрагмента.

Еще одна стратегия секвенирования протяженных фрагментов ДНК, названная авторами RANDI (RANdom and Directed), изначально предполагает определение нуклеотидных последовательностей как с помощью методов случайного подхода (на первом этапе), так и оставшихся неперекрытыми участков, с помощью направленного подхода на втором этапе [Voss et al., 1995]. Схожий принцип был заложен при разработке стратегии, названной "Sequence scanning", что можно перевести как "секвенирование сканированием" [Nurminsky, Haiti, 1996]. Авторами данной работы на основе фагового вектора AZAP (Stratagene, США) был специально создан вектор LambdaScan, рассчитанный на субклонирование 8-12 тпн вставок и последующее секвенирование их концов. Исходным материалом служили клонированные ранее в бактериофаге Р1 фрагменты ДНК с размером около 100 тпн. Необходимым этапом этой стратегии является секвенирование концевых участков (по 350-500 пн) с обеих сторон вставок у достаточного числа полученных случайных субклонов с использованием в качестве мест для отжига праймеров векторных последовательностей, граничащих со вставкой. Проведенные подсчеты показывают, что подобное секвенирование 192 таких субклонов (по числу лунок микротитратора) даст первичную информацию о 135-192 тпн и при этом участки, "прочитанные" по обеим цепям, по одной и еще не секвенированные вовсе, будут соотноситься как 1:2:1. По мнению авторов, компьютерная состыковка должна дать информацию об участках исходного клона, секвенирование которых должно быть продолжено уже стратегией направленного подхода. Несколько иной подход, направленный на уменьшение числа секвенируемых случайных клонов, был предложен другими авторами [SchoUer et al., 1995]. Так, для исключения из секвенирования лишнего количества случайных субклонов в фагмидном векторе исходного 11,5 тпн фрагмента ДНК ими была проведена гибридизация ДНК данных субклонов с декамерными олигонуклеотидами. Это позволило распределить полученные субклоны по группам перекрытия и, таким образом, уменьшить количество секвенируемых матриц.