Эволюция методов секвенирования днк

Определение "Эволюция методов секвенирования днк" в ЭБНБ

Эволюция секвенирования ДНК химической деградацией

Те высоты, которых достигла в последнее время молекулярная биология, стали во многом возможны благодаря разработанным во второй половине 1970-х годов быстрым методам секвенирования ДНК. Слишком важной и нужной оказалась информация о последовательности нуклеотидов в ДНК. Даже простое перечисление того, к чему уже привело ее знание у нескольких полных геномов, огромного числа генов и прочих фрагментов ДНК, заняло бы достаточно много места. И еще большего можно ждать от секвенирования ДНК в будущем, поскольку "самая главная молекула" еще раскрыла не все свои "тайны".

Эволюция секвенирования ДНК комплиментарными цепями

При этом нельзя не видеть, что нынешнее секвенирование ДНК уже только напоминает то, что было в самом начале. Сегодня, исходя из стоящих перед конкретными исследователями задач, можно сказать, что есть разное секвенирование ДНК. Так, как и в догеномную эру, многие лаборатории продолжают проводить обычное секвенирование отдельных генов и прочих фрагментов ДНК и получаемые в процессе этих экспериментов сведения не потеряли своей актуальности, несмотря на начавшееся несколько лет назад секвенирование полных геномов некоторых организмов, которое превратилось в настоящее производство, где многие операции полностью автоматизированы. Последнее является достижением уже не только молекулярной биологии, а и смежных областей науки и техники.

Эволюция секвенирования ДНК электрофоретическим разделением

Словом, секвенирование ДНК, включая многочисленные его составляющие, за четверть века своего эволюционирования претерпело целый ряд многочисленных преобразований и улучшений. Как и в обычных эволюционных процессах возникали и тупиковые ветви, не оказавшие заметного воздействия на общее развитие того, что называется секвенированием ДНК. Однако отражение только нынешнего состояния дел (или применяемых подходов) в секвенировании ДНК просто невозможно, хотя бы по той причине, что оно очень разнообразно. Так, например, в обычном секвенировании ДНК на нынешнем этапе кто-то предпочитает использовать одноцепочечные матрицы ДНК, кто-то - двуцепочечные, другие же определяют последовательность ДНК с помощью только циклического секвенирования. Сходная ситуация наблюдается и с типом используемых меток, где выбор простирается от классического радионуклида 32Р до самых последних флуоресцентных красителей. Для них, правда, требуется уже специальная дорогостоящая техника, тогда как разделение фрагментов ДНК, меченных радионуклидами, возможно в приборе весьма простой конструкции, где центральным элементом служат два стекла, которые должны быть все-таки высокого качества. Что касается автоматического секвенирования, то и тут есть выбор между привычным стандартным электрофорезом в пластинах геля и более скоростным капиллярным гель-электрофорезом.

Оказалось, что даже такой бурно развивающийся раздел молекулярной биологии, как секвенирование ДНК, все же можно (хотя где-то и весьма кратко) вместить в одну книгу и четверть века это еще тот период времени, который вполне поддается охвату, попытка чего и была сделана в данной книге. Причем все же следует отметить (не желая при этом показаться нескромными), что подобного описания методов секвенирования ДНК нам нигде прежде не встречалось. Однако, на наш взгляд, оно было бы незавершенным, если не попытаться отразить хотя бы основные направления их эволюционного развития, чему и посвящена эта глава.

Еще одной особенностью данной главы является полное отсутствие ссылок на литературные источники. Пожалуй, главной причиной этого служит то, что в ходе всего предшествующего изложения различные новшества процесса секвенирования ДНК с приведением литературных ссылок уже упоминались. Подрисуночная расшифровка пронумерованных ветвей эволюционных деревьев лишь кратко характеризует какую-либо веточку. Особо следует оговорить то, что "толщина" деревьев и их веток достаточно произвольна и мало соответствует "годовым" кольцам того или иного подхода, способа или некоторого улучшения метода секвенирования ДНК. "Высота" деревьев также весьма условна, поскольку в подавляющем большинстве случаев невозможно точно определить время забвения какого-либо подхода или способа. Также следует заметить, что "абсолютно правильного" расположения ветвей нам достичь не удалось, поскольку для этого необходимо уже трехмерное пространство, а плоская схема есть плоская схема.

Чтобы не перегружать рисунки и не устраивать "непроходимую чащу" и одновременно не делать большое их количество, мы решили стандартное секвенирование ДНК уместить всего в 3 рисунках, условно разделив весь процесс на две стадии. К первой оказалось отнесено все то, что предшествует электрофоретическому разделению продуктов секвенирующих реакций. Вторая стадия состоит из самого электрофореза и некоторых последующих процедур. Таким образом, "нарисованными" оказались только все вариации двух классических методов секвенирования ДНК по Максаму-Гилберту и Сэнгеру.

Что касается заключительного этапа секвенирования ДНК в виде компьютерной обработки результатов, то его изображение в виде эволюционных древ привело бы к формированию таких раскидистых крон, что в них бы было чрезвычайно трудно разобраться. Заняться же их искусственной "обрезкой" не поднялась рука, в связи с чем эта схема оказалась не нарисованной. Также не оказались изображенными и все прочие методы секвенирования ДНК, отчасти по причине того, что многие из них представляют собой только молодую поросль, еще не сильно обросли ветками (модификациями), да и "высота" их будет весьма незначительна, хотя необходимо отметить, что потенциал некоторых из них весьма велик.

В качестве, видимо, некоторых необходимых пояснений представленных ниже рисунков следует отметить, что "главные стволы" представляют собой только сам принцип секвенирования ДНК тем или иным методом, а также электрофоретическое разделение продуктов секвенирующих реакций. Так, в основе метода секвенирования ДНК путем химической деградации по Максаму-Гилберту лежит ограниченное расщепление меченного по одному концу фрагмента ДНК под действием реагентов, специфичных к определенному типу оснований нуклеотидов. Это и есть сам ствол одного из деревьев (рис.). Другой принадлежит методу секвенирования ДНК, разработанному Сэнгером и соавт. и основанному на принципе ферментативного построения меченой комплементарной цепи ДНК по существующей одноцепочечной матрице с помощью ДНК-полимеразы при происходящем в разных местах цепи ДНК ингибировании ее дальнейшего роста за счет включения дидезоксинуклеотидов (рис.).

Третий ствол олицетворяет собой разделение по размеру меченых продуктов, образующихся как в ходе химической деградации в методе Максама-Гилберта, так и в результате специфической терминации цепи ДНК в методе Сэнгера, и осуществляется с помощью высоковольтного электрофореза в полиакрил амид ном геле высокого разрешения, позволяющего разделять фрагменты ДНК, отличающиеся между собой по длине всего на один нуклеотид, в достаточно широком диапазоне (рис.).