ДНК чип


Значение термина ДНК чип в Энциклопедии Научной Библиотеки



ДНК чип - Другой альтернативный подход к секвенированию ДНК посредством гибридизации, так называемый формат 2, заключается в инкубации сорбированных на подходящем носителе в строго
Реконструирование нуклеотидной последовательности
определенных местах коротких олигонуклеотидов с находящейся в растворе секвенируемой меченой ДНК [Лысов и др., 1988; Bains, Smith, 1988; Khrapko et al., 1989; Southern, 1992]. Определение последовательности нуклеотидов этим методом состоит из нескольких экспериментальных стадий и анализа полученных результатов. Так, после завершения гибридизации и последующей отмывки происходит выявление среди множества остальных только тех олигонуклеотидов, которые сформировали совершенные дуплексы с одноцепочечной ДНК, находящейся в растворе. Поскольку последовательность самих олигонуклеотидов (которые могут быть представлены как подпоследовательность конкретного участка ДНК) известна, то анализ олигонуклеотидов, вступающих в гибридизацию, позволяет определить среди них таковые с перекрывающимися последовательностями и рассчитать их расположение друг относительно друга, что и приводит в итоге к реконструкции последовательности нуклеотидов секвенируемого фрагмента ДНК. Примечательной особенностью этого метода можно считать возможность "чтения" последовательности ДНК в обоих направлениях и с любого произвольного места, последовательно находя перекрывающиеся олигонуклеотидные блоки. К другой важной черте секвенирования ДНК-гибридизацией можно отнести то, что даже в одном эксперименте практически каждый нуклеотид в секвенируемом фрагменте ДНК "читается" многократно. Так, например, при использовании октануклеотидной матрицы для большинства нуклеотидов повторное "чтение" будет осуществляться еще 7 раз за счет перекрытия последовательностей данных олигонуклеотидов с таковой у выбранного в качестве первого. К недостатку, присущему, главным образом, формату 2, можно отнести влияние сильной вторичной структуры отдельных участков секвенируемого фрагмента ДНК, не позволяющей образовывать с ней дуплексы олигонуклеотидам, фиксированным в матрице.

Таким образом, основными составляющими процесса секвенирования ДНК посредством гибридизации являются сама секвенируемая ДНК, несущая подходящую метку, и полный набор олигонуклеотидов определенной длины, формирующих специальную олигонуклеотидную матрицу. За годы, прошедшие со времени разработки данного метода, все эти элементы претерпели существенные изменения. Так, в ранних экспериментах в качестве метки использовались радиоактивно меченные молекулы, что требовало этапа радиоавтографии или применения специальных приборов, как, например, Phosphorlmager (Molecular Dynamics, США) или ему подобных. Впоследствии радиоактивная метка была заменена флуорофорами, что позволило в еще большей степени автоматизировать весь процесс сбора данных, использовав при этом флуоресцентный микроскоп, и создать таким образом прототип автоматического секвенатора ДНК, включавший также CCD-камеру и компьютер [Мирзабеков, 1992; Mirzabekov, 1994; Yershov et al., 1996]. Следует отметить специально написанную компьютерную программу DNA-SPEKTRUM, позволяющую проводить реконструкцию последовательности нуклеотидов секвенированного фрагмента ДНК и обладающую целым рядом других сервисных функций для данного метода секвенирования ДНК [Belyi, Pevzner, 1997].

Центральным элементом метода секвенирования ДНК-гибридизацией служит олигонуклеотидная матрица, или микрочип, на котором в строго определенных местах фиксированы конкретные олигонуклеотиды с известной последовательностью. Если для использования данного метода в диагностических целях можно ограничиться лишь несколькими конкретными олигонуклеотидами, то для секвенирования de novo необходимо иметь полный набор олигонуклеотидов, состоящий из 4n вариантов. При этом считается, что длина фрагмента ДНК, который можно "просеквенировать" в одном эксперименте, приблизительно равна квадратному корню из числа всех возможных олигонуклеотидов в данном наборе [Southern et al., 1992]. В работе Певзнера и соавт. [Певзнер и др., 1991] приведено приблизительное соотношение длины применяемых олигонуклеотидов в матрице и протяженности фрагмента ДНК, нуклеотидная последовательность которого может быть однозначно установлена. Так, например, около 2,5 тыс. нуклеотидов теоретически можно "прочитать" в одном эксперименте с помощью полного набора олигонуклеотидов, состоящих из 12 звеньев. Однако сама матрица при этом будет состоять из огромного числа 16 777 216 вариантов. Набор из 262 144 9-мерных олигонуклеотидов, хотя теоретически и позволяет однозначно определять нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК протяженностью около 500 нуклеотидов, в настоящее время слишком велик для изготовления подобной матрицы. Достаточно оптимальной можно считать матрицу с длиной олигонуклеотидов, равной 8 звеньям, что составляет всего 65 536 всех возможных вариантов таких молекул, изготовление которой также весьма не простой процесс. Приведенная на рис. 13.1 несколько упрощенная схема иллюстрирует процесс восстановления последовательности нуклеотидов исследуемого фрагмента ДНК именно с помощью октануклеотидной матрицы.

Как будет видно из дальнейшего изложения, в процессе продолжающейся разработки метода секвенирования ДНК посредством гибридизации предлагались различные варианты модификации олигонуклеотидов как иммобилизованных в матрице, так и образования на их основе за счет стэкинг-взаимодействий некоего гибридизационного комплекса с участием более коротких олигонуклеотидов, как несущих, так и не несущих метку.

Не осталась без изменения и твердая фаза, на которой фиксировались синтезированные олигонуклеотиды. Так, первоначально некоторый недостаток секвенирования ДНК-гибридизацией с помощью формата 2 по сравнению с описанным в предыдущем разделе форматом 1 заключался в плохой сорбции коротких олигонуклеотидов ДНК на мембранных фильтрах. Чтобы преодолеть это препятствие, разными авторами были применены отличающиеся способы их фиксации. Так, в некоторых случаях в качестве носителя выступало модифицированное стекло [Maskos, Southern, 1992] или полипропилен с аминогруппами [Matson et al., 1995; Weiler, Hoheisel, 1996]. Описывается применение процесса фотолитографии для создания матриц с 256 различными октануклеотидами [Fodor et al., 1993; Pease et al., 1994]. Весьма сложным расположением ячеек характеризуется олигонуклеотидная матрица, созданная Саузерном и соавт. [Southern et al., 1992; Southern et al., 1994; Southern, 1996]. Целая серия работ этой группы авторов была посвящена анализу особенностей взаимодействия олигонуклеотидов, фиксированных на данной матрице, при их гибридизации с мишенью [Southern et al., 1994; Williams et al., 1994]. Специальное исследование было направлено на оценку стабильности образующихся дуплексов мишени с олигонуклеотидами, содержащими дезоксиинозин как универсальное основание [Case-Green, Southern, 1994]. В недавней работе этих авторов изучались стерические факторы, воздействующие на эффективность гибридизации олигонуклеотидов, фиксированных при помощи специального спейсера на полипропиленовой матрице, содержащей функциональные аминогруппы [Shchepinov et al., 1997]. Было обнаружено, что оптимальная длина спейсера в 40 атомов повышала эффективность гибридизации в 150 раз.

Отечественные ученые под руководством А.Д. Мирзабекова остановили свой выбор на использовании в качестве носителя тонкого слоя 8%-ного полиакриламидного геля, приполимеризованного к стеклу, обработанному γ-метакрилоксипропилтриметоксисиланом [Храпко и др., 1991]. К преимуществам данного подхода можно отнести хорошую прозрачность и прочность этого носителя, а также его значительную емкость и, как следствие, увеличенное количество молекул сорбируемых олигонуклеотидов и более высокий уровень гибридизационного сигнала. В то же время возникла проблема проникновения меченого секвенируемого фрагмента ДНК внутрь такого матрикса, что, впрочем, было решено этими авторами путем некоторой фрагментации исследуемой ДНК. Сорбцию окисленных периодатом натрия олигонуклеотидов, содержащих 3-метилуридин в качестве линкера, проводили на матрице, полиакриламидный матрикс которой был предварительно подготовлен обработкой гидразингидратом [Храпко и др., 1991]. В дальнейшем, кроме полиакриламидного геля, исследовалась возможность применения для этих целей и сополимерных полидиметил-акриламидных гелей, содержащих в качестве реакционноспособных альдегидную или аминную группы [Timofeev et al., 1996]. Так, активная альдегидная группа показала более высокую эффективность иммобилизации олигонуклеотидов. Полидиметил-акриламидный гель в отличие от обычного полиакриламидного позволил провести его дополнительную обработку в органических растворителях.

Недавно Мирзабековым и соавт. [Василисков и др., 1998] разработан новый способ изготовления микрочипов с улучшенными свойствами, заключающийся в сополимеризации 4%-ного полиакриламида с синтезированными олигонуклеотидами, несущими на 5'-конце аллильную группу, добавляемую на последнем этапе обычного синтеза в виде аллильного производного фосфорамидита. За счет этого было достигнуто более равномерное распределение олигонуклеотидов по всему объему гелевой ячейки и процесс полимеризации (изготовления ячеек) и иммобилизация ("пришивка" олигонуклеотидов) проходили в одну стадию в отличие от формирования ячеек с помощью робота, описанного в другой работе этих же авторов [Yerskov et al., 1996].

Сам размер олигонуклеотидной матрицы, или микрочипа, за эти годы изменился также весьма существенно. Так, первые конструкции изготавливались вручную, механически удаляя часть полимеризованного геля с целью получения квадратов со сторонами в 200 мкм, разделенных полосками чистого стекла шириной 300 мкм [Храпко и др., 1991]. Толщина гелевого слоя составляла 30 мкм. Совершенствование подобных чипов для процесса секвенирования ДНК посредством гибридизации привело к созданию ячеек толщиной 20 мкм и размером 40x40 мкм, разделенных промежутками в 80 мкм [Yershov et al., 1996]. Для изготовления таких миниатюрных чипов, имеющих общий размер 1x1 см, и способных нести в ячейках гелевого матрикса, полимеризованного на стекле, от 20 до 30 тыс. вариантов олигонуклеотидов, был создан специальный робот. Авторы сообщают, что подобный микрочип выдерживал до 15 и в отдельных случаях до 50 гибридизаций, а перед использованием мог храниться в высушенном виде при 4 °С в течение года. Для иммобилизации же этим способом полного набора всех возможных октануклеотидов, состоящего из 65536 вариантов, потребовалась бы стеклянная пластинка с размерами около 3x3 см.

Относительно недавно этой же группой авторов была предложена простая процедура, позволяющая ручным способом изготовить аналогичный микрочип с еще меньшими размерами ячеек (25x25 мкм), разделенных полосками гидрофобизированной поверхности покровного стекла к микроскопу, на котором и размещались данные ячейки [Guschin et al., 1997]. Дальнейшая миниатюризация подобных ДНК-чипов привела к созданию с помощью специально сконструированного микроскопа фрагмента матрицы с гелевыми ячейками размером всего 10x10x5 мкм [Василисков и др., 1998].

Молекулярная гибридизация иммобилизованных олигонуклеотидов с меченой ДНК проводится при температуре около 0°С и после серии отмывок при температуре гибридизации с дальнейшим дискретным повышением на 5°С, обеспечивающих удаление несвязавшейся мишени и диссоциации несовершенных дуплексов осуществляется детекция флуоресцирующих (или в ранних экспериментах дающих сигнал при радиоавтографии) ячеек, свидетельствующая об образовании содержащимися в них олигонуклеотидами совершенных дуплексов с секвенируемой ДНК. Одним из ключевых моментов метода секвенирования ДНК с помощью гидридизации с олигонуклеотидными матрицами является четкое разграничение тех ячеек с совершенными дуплексами от таковых, несущих отдельные неспаренные нуклеотиды. Учитывая важность постгибридизационной отмывки, ей была посвящена отдельная статья, детально рассматривающая различные теоретические аспекты этого процесса [Лившиц и др., 1992; Livshits et al., 1994]. Не меньший интерес представлял и расчет кинетики гибридизации секвенируемой ДНК с олигонуклеотидами, иммобилизованными в слое полиакриламидного геля. Специальное исследование данного аспекта метода указало пути оптимизации этого процесса, позволяющие осуществить лучшую дискриминацию совершенных дуплексов от несовершенных [Лившиц, Мирзабеков, 1996]. Использование в модельном эксперименте вместо секвенируемого фрагмента ДНК флуоресцентно меченных олигонуклеотидов и их гибридизации с иммобилизованными в микрочипе показало некоторую зависимость прочности образующихся дуплексов от наличия выступающих на 3'- и/или 5'-концах нескольких нуклеотидов, которые могли быть или вырожденными или универсальными в виде 5-нитроиндола [Fotin et al., 1998].

Одной из серьезных проблем, присущих секвенированию ДНК посредством гибридизации, является разная температура диссоциации для AT- и GC-богатых олигонуклеотидов. Для ее преодоления предлагались различные варианты, включая увеличение длины АТ-богатых октануклеотидов еще на один нуклеотид. Однако более простое решение заключается в добавлении в гибридизационный буфер бетаина или тетраметил-аммоний-хлорида, известных тем, что они сглаживают различия в температурах плавления AT- и GC-пар [Wood et al., 1985; Rees et al., 1993; Bains, 1994]. Хотя следует отметить, что в литературе содержатся сведения о том, что тетраметил-аммоний-хлорид не универсален и с некоторыми последовательностями ДНК его эффект мало заметен [Riccelli, Benight, 1993]. Так, было показано, что добавление тетраметил-аммоний-хлорида позволило использовать один гибридизационный буфер только для 90% всех олигонуклеотидов с разными AT- и GC-составами при условии обеспечения температурного различия в 2°С для плавления совершенных и несовершенных дуплексов [Bains, 1994]. Однако в отсутствии тетраметиламмонийхлорида при стандартных условиях гибридизации подобное условие выполняется лишь для 60% олигонуклеотидов.

Обнаруженный эффект увеличения температуры диссоциации дуплексов на 5°С при трехкратном увеличении их концентрации в матриксе, представленном полиакриламидным гелем, был использован Мирза-бековым и соавт. для выравнивания температур плавления октануклеотидов с разными GC-составом, что необходимо для лучшей идентификации совершенных и несовершенных дуплексов [Храпко и др., 1991; Khrapko et al., 1991]. Так, одним из "тонких" мест данного метода секвенирования ДНК является как раз детекция только совершенных дуплексов, не содержащих неспаренных нуклеотидов, поскольку в противном случае будет внесена ошибка, делающая дальнейшую реконструкцию ДНК или невозможной или неправильной. Считается, что наибольшие трудности подстерегают экспериментатора при выявлении несовершенных дуплексов в случае наличия в них терминальных неспаренных нуклеотидов и, в частности, пар G-T и G-A [Mirzabekov, 1994].

Выявление с помощью ДНК-лигазы и ДНК-полимеразы подобных неспаренных нуклеотидов (пары G-T и G-A) в образовавшихся дуплексах при секвенировании ДНК посредством гибридизации, контролируемое путем подсчета радиоактивности, было предпринято в модельном эксперименте другими авторами [Broude et al., 1994]. Под действием ДНК-лигазы проводилось лигирование встык отожженой мишени на выступающем конце двуцепочечного олигонуклеотида, а ДНК-полимераза вызывала удлинение образовавшегося в результате отжига углубленного 3'-конца. Этот подход был основан на известном факте худшего узнавания подобных конструкций данными ферментами, однако полученные ими данные вряд ли могут быть прямо проецированы на более обычный вариант секвенирования гибридизацией, поскольку здесь в качестве твердой фазы служили магнитные частицы, покрытые стрептавидином, а один из олигонуклеотидов содержал молекулу биотина. Более того, одноцепочечный участок двух комплементарных друг другу олигонуклеотидов, доступный для гибридизации с мишенью, был представлен всего 5 нуклеотидами. (Такое внимание к этой работе вызвано тем, что она будет упомянута еще в конце данной главы.)

Как уже отмечалось выше, предел "чтения" с помощью теоретически приемлемой ныне октануклеотидной матрицы невелик. На использование же матриц с увеличенной длиной иммобилизованных олигонуклеотидов за счет значащего числа звеньев в них в настоящее время невозможно даже рассчитывать. Причем за счет увеличения длины секвенирующих олигонуклеотидов в матрице на одно звено предел "чтения" повысится всего в 2 раза, тогда как число ячеек в самой матрице возрастет уже в 4 раза. Некое решение проблемы уменьшения числа вариантов олигонуклеотидов в матрице при одновременном увеличении их длины заключалось в добавлении во время синтеза в их центральную часть вырожденных нуклеотидов. Подобные "окта"-нуклеотиды, названные авторами "разнесенными", имели вид ACGTNNACGT, где N означает смесь всех четырех нуклеотидов [Певзнер и др., 1991; Pevzner et al., 1991]. Таким образом, иммобилизованный в геле подобный "окта"-нуклеотид содержал в каждой ячейке все 16 возможных вариантов декамеров. Авторы считают, что за счет этого удается в 5-15 раз снизить число вариантов используемых олигонуклеотидов без уменьшения разрешающей способности метода. Описано и применение октануклеотидов, ставших 12-мерами за счет добавления сразу четырех вырожденных нуклеотидов [Лысов и др., 1995; Southern, 1996]. Это привело к присутствию в каждой ячейке уже 256 вариантов олигонуклеотида, что в свою очередь рождает новые проблемы. В другой работе в результате компьютерной симуляции при анализе известной последовательности ДНК человека было рассчитано, что использование 65536 11-меров с 3 вырожденными нуклеотидами позволит определять уже до 800 нуклеотидов в одном эксперименте [Bains, 1993]. Принимая во внимание открытую рамку считывания, при секвенировании кДНК с помощью матрицы с подобными вырожденными 11-мерами можно в идеальных случаях повысить предел "чтения" до 2400 нуклеотидов [Bains, 1993 а].

Иной путь увеличения длины олигонуклеотидов заключался в добавлении во время гибридизации секвенируемого фрагмента ДНК с иммобилизованными октануклеотидами еще и коротких пентануклеотидов, как и сам секвенируемый фрагмент ДНК, находящихся в растворе [Лысов и др., 1993; Khrapko et al., 1991; Lysov et al., 1994]. За счет образующихся стэкинг-взаимодействий это позволило как бы увеличить длину октануклеотида, находящегося в ячейке матрицы или микрочипа, что, в свою очередь, привело к повышению достоверности и эффективности секвенирования ДНК. Данный способ теоретически позволяет с помощью 1024 (45) пентамеров и 65536 (48) октамеров в какой-то степени имитировать огромную библиотеку 13-меров, которая бы состояла из 67108864 (413) вариантов. Так, повторные гибридизации встык с различными наборами пентануклеотидов увеличивают длину секвенируемого с помощью октануклеотидной матрицы фрагмента ДНК с 200 до нескольких тысяч нуклеотидов. Использование одного или двух пентамеров, несущих различные флуорофоры, и гибридизирующихся встык с основным октануклеотидом и первым пентамером соответственно позволило увеличить эффективную длину секвенирующего олигонуклеотида до 13 и даже до 18 звеньев [Parinov et al., 1996]. Включение в состав данных пентамеров или всех четырех нуклеотидов в виде вырожденного нуклеотида или 5-нитроиндола, как универсального основания, привело к сокращению числа дополнительных раундов гибридизации. Объединение этих двух подходов с использованием олигонуклеотидов с вырожденными основаниями и гибридизации встык с находящимися в растворе пентамерами показывает возможность сокращения числа дополнительных гибридизаций примерно вдвое с сохранением той же эффективности реконструкции секвенируемого фрагмента ДНК [Лысов и ДР., 1995].

Выше уже отмечалось, что значительные трудности подстерегают экспериментатора при секвенировании посредством гибридизации фрагментов ДНК, содержащих повторяющиеся последовательности. Так, при реконструкции нуклеотидной последовательности подобных фрагментов ДНК возникают неоднозначности в выборе того или иного октануклеотидного варианта и образования, таким образом, мест ветвления [Лысов и др., 1993]. Показано, что их частичное преодоление может быть достигнуто путем формирования серии из нескольких коротких разных (меченых и не меченных) олигонуклеотидов, первые из которых гибридизируются встык с основным олигонуклеотидом, а вторые уже с ними [Лысов и др., 19946]. Дополнительная информация в виде предварительно измеренной длины секвенируемого фрагмента, содержащего повторы, или с помощью ПЦР, или рестриктазным анализом также позволяет повысить эффективность секвенирования подобной ДНК методом гибридизации [Лысов и др., 1994а; Lysov et al., 1996]. Полностью процедура реконструкции последовательности ДНК в подобном случае может быть представлена следующей схемой, приведенной в работе Лысова и соавт. [Лысов и др., 1993] и здесь несколько сокращенной. Так, после гибридизации секвенируемого фрагмента ДНК на олигонуклеотидной матрице и анализа образовавшихся совершенных дуплексов рассчитывается полный СГОМ-спектр, представляющий собой список всех олигонуклеотидов, встречающихся в секвенируемом фрагменте ДНК, с учетом количества вхождений каждого такого олигонуклеотида в анализируемую последовательность. Следующим этапом является анализ этого СГОМ-спектра на наличие повторов, приводящих к образованию точек ветвления. Для того чтобы прийти к однозначной реконструкции, проводится составление списков так называемых предыстории и продолжений в выявленных точках ветвления. Затем следуют подбор вариантов следующей гибридизации "встык" с определенными пентамерами, ее проведение и дальнейший анализ, приводящий или к однозначно "прочитанной" последовательности секвенируемого фрагмента ДНК, или к повторению этапов гибридизации "встык". В литературе содержатся сведения также и о других подходах к решению проблемы неоднозначного "чтения" нуклеотидной последовательности ДНК, содержащей повторы при секвенировании гибридизацией [Кузнецова и др., 1994; Dubiley et al., 1997].

Интересные результаты были получены при компьютерном анализе нуклеотидной последовательности протяженного фрагмента ДНК человека размером 522 тпн [Bains, 1994]. Было показано, что 75% 12-мерных и 89% 22-мерных олигонуклеотидов являются уникальными для анализируемого фрагмента, однако произвольной случайной ДНК аналогичного размера были бы присущи несколько иные соотношения. Так, уже 89% 12-мерных олигонуклеотидов были бы в этом случае уникальными, а для 22-мерных эта цифра составила бы все 100%. Подобное несовпадение можно объяснить как имеющимися повторами в геномной ДНК человека, так и просто "случайно" встречающимися олигонуклеотидными блоками, не входящими в состав специфических повторяющихся элементов. Однако олигонуклеотидная матрица, состоящая из более чем 17 триллионов вариантов всех 22-меров, причем также не обеспечивающая фронтальное секвенирование геномов, просто нереальна.

К сожалению, общая производительность метода секвенирования ДНК посредством гибридизации пока не очень невысока [Chetverin, Kramer, 1993]. Считается, что с помощью полного набора октануклеотидов (65536 вариантов) можно секвенировать de novo фрагменты ДНК протяженностью лишь около 200 пн [Hannenhalli et al., 1996]. Увеличение длины олигонуклеотидов, фиксированных на матрице, позволяет увеличить длину чтения до 400 нуклеотидов и более, но число вариантов самих олигонуклеотидов возрастает при этом катастрофически. Смешанный вариант секвенирования ДНК посредством гибридизации и обычным ферментативным методом, теоретически позволяющий за 5-7 экспериментов определить последовательность фрагмента ДНК размером 10 тпн, был предложен Бэйнсом [Bains, 1993b]. Этот же автор ранее отмечал, что метод секвенирования ДНК-гибридизацией значительно проще ферментативного и требует меньшего количества обученного персонала [Bains, 1991].

В литературе описан интересный способ детекции сигналов гибридизации на ДНК-биочипе [Arlinghaus et al., 1997b]. Главной отличительной особенностью данного чипа является то, что вместо стандартных олигонуклеотидов на нем фиксированы химерные молекулы олигонуклеотидов, так называемые PNA (Peptide Nucleic Acids), где скелет такой молекулы образуется благодаря наличию N-(2-аминоэтил)глициновых остатков и фосфодиэфирные связи между азотистыми основаниями, таким образом, заменены амидными. Детекция сигналов гибридизации, проводящаяся с помощью ионизационной масс-спектрометрии, рассчитана на детекцию атомов фосфора, присутствующих только в тех участках биочипа, где произошла гибридизация, поскольку все остальные ячейки его не содержат. Здесь, видимо, следует отметить, что подобные пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК) были синтезированы уже достаточно давно и была показана возможность формирования двойной спирали с комплементарными им обычными олигонуклеотидами [Nielsen et al., 1991; Egholm et al., 1993; Wittung et al., 1994]. Так, Саузерн в своей обзорной статье [Southern, 1996] упоминает о подобных соединениях и о потенциальной возможности их использования в качестве олигонуклеотидных матриц, однако отмечает, что подобные сведения в литературе на тот момент отсутствовали. В настоящее время сфера применения этих химерных соединений в молекулярной биологии и биотехнологии весьма широка и продолжает расширяться, рассмотрению чего посвящен целый ряд обзорных статей [Buchardt et al., 1993; Corey, 1997; Uhlmann, 1998; Wang, 1998]. Так, ПНК нашли применение в блот-гибри-дизации по Саузерну в качестве гибридизационных зондов [Реггу-O'Keefe et al., 1996]. Оказалось, что гибридизация ДНК с ПНК происходит даже быстрее, чем с обычными зондами, и образующиеся при этом связи заметно прочнее [Iyer et al., 1995]. В то же время наличие единичных неспариваемых нуклеотидов оказывает заметное влияние на этот процесс, что привело к их использованию в качестве зондов для выявления единичных мутаций [Wang et al., 1997]. Так, для подобных целей были разработаны специальные матрицы с иммобилизованными ПНК [Wang et al., 1997; Weiler et al., 1997]. Для лучшего понимания происходящих взаимодействий данных химер, содержащих пептидный остов с настоящими нуклеиновыми кислотами, при формировании двуцепочечных и трехцепочечных структур был проведен теоретический анализ, позволивший предположить существование двух стадий этого процесса [Lomakin, Frank-Kamenetskii, 1998].

Другое теоретически возможное усложнение метода секвенирования ДНК-гибридизацией, имеющее целью повысить его производительность, видится в использовании отдельных элементов из метода секвенирования ДНК путем синтеза. Так, увеличение числа нуклеотидов, например, в ячейке октануклеотидной матрицы с 8 до 9, возможно путем присоединения с помощью ДНК-полимеразы соответствующего ддНМФ, комплементарного очередному нуклеотиду секвенируемого фрагмента ДНК. Непременным условием является применение ддНТФ, меченных различными флуорофорами, отличающимися своими спектрами эмиссии друг от друга, а также от основной метки, принадлежащей самому секвенируемому фрагменту ДНК, что позволит (теоретически) осуществить и этап гибридизации и удлинение данного олигонуклеотида, выступающего здесь в качестве праймера в одну стадию с последующей детекцией флуоресцентных сигналов, принадлежащих и ддНМФ и фрагменту ДНК, с помощью соответствующих фильтров. Что касается ДНК-полимеразы, то учитывая низкую температуру гибридизации, необходимо использовать эффективно работающий при подобных температурах фермент, выделенный из какого-либо психрофильного микроорганизма. Кроме этого, видимо, необходимо предварительное удаление 3'-5'-экзонуклеазной активности этой ДНК-полимеразы. При этом можно предполагать даже улучшенную дискриминацию совершенных и несовершенных дуплексов, причем наиболее трудных в выявлении концевых неспаренных нуклеотидов за счет показанной ранее избирательности ДНК полимеразы к подобным затравочным комплексам [Broude et al., 1994]. Неким отрицательным моментом данного способа можно считать некоторое увеличение общего фона за счет присутствия большого количества флуоресцентно меченных ддНТФ, хотя этот недостаток может быть и преодолим. Другим препятствием к использованию этого подхода можно считать наличие самого матрикса в виде полиакриламидного геля, который может не дать возможность ДНК-полимеразе проявить свое ферментативное действие.

Неким решением проблемы в этом случае может стать снижение концентрации полиакриламида и уменьшение его"сшивки".

Следует отметить, что ранее подобное ферментативное удлинение олигонуклеотида в ячейке полиакриламидного геля было невозможно из-за применявшегося способа иммобилизации посредством расположенного на 3'-конце 3-метилуридина [Храпко и др., 1991]. Разработанный вариант сополимеризации полиакриламида с олигонуклеотидами, несущими на 5'-конце аллильную группу [Василисков и др., 1998], оставляет свободным их 3' -конец и позволяет, таким образом, каждому конкретному олигонуклеотиду служить в качестве затравки для полимеразной реакции.

Завершая рассмотрение метода секвенирования ДНК посредством гибридизации, следует отметить, что развитие формата 2 активно продолжается в отличие от формата 1, который менее пригоден для автоматизации и значительно сложнее в исполнении. Наблюдаемый в последние годы перенос технологий из микроэлектронной промышленности в биотехнологию в виде создания биочипов уже оказывает революционизирующее воздействие в этой сфере [Chee et al., 1996; Sosnovwski et al., 1997; Edman et al., 1997; Case-Green et al., 1998; Livache et al., 1998].

Реконструирование нуклеотидной последовательности Реконструирование нуклеотидной последовательности >>>>


читайте так-же
ДнищаВ начало
буква "Д"
буквосочетание "ДН"
ДНК-полимераза

Статья «ДНК чип» была прочитана 5049 раз