Гибридизация олигонуклеотидов с днк

Определение "Гибридизация олигонуклеотидов с днк" в ЭБНБ

Метод молекулярной ДНК/ДНК-гибридизации какого-либо зонда, представляющего собой определенный фрагмент одноцепочечной ДНК, с фиксированной на мембранном фильтре другой одноцепочечной ДНК, известен достаточно давно и применяется в молекулярной биологии при решении большого числа задач чрезвычайно широко. Однако цели в виде определения последовательности нуклеотидов сорбированной ДНК при этом ранее никогда не ставилось. Подобная попытка была совершена югославскими авторами, детально описавшими в своей статье теорию самого метода [Drmanac et al., 1989], причем ранее в 1987 г. ими был получен югославский патент на данный метод. Так, они показали, что характер гибридизации сорбированного на нейлоновом фильтре исследуемого фрагмента ДНК с короткими олигонуклеотидными зондами (длиною от 11 до 20 звеньев) позволяет реконструировать последовательность нуклеотидов в этом секвенируемом фрагменте. В дальнейшем ими была продемонстрирована возможность секвенирования с помощью данного метода фрагмента ДНК протяженностью 100 пн [Strezoska et al., 1991]. Предложенная автоматизация всего процесса гибридизации (секвенирования) теоретически могла позволить определять до 100 мпн в год [Drmanac et al., 1992]. Но при этом предполагался гигантский объем экспериментальной работы по подготовке самих образцов ДНК, их гибридизации с олигонуклеотидными зондами и последующим анализом полученных результатов, требующим каждодневного обсчета около 5 млн гибридизационных сигналов. В своей другой статье эти авторы предположили, что секвенирование ДНК посредством гибридизации может ускорить прохождение фазы картирования генома человека при выполнении этого глобального проекта [Drmanac et al., 1993].

Главным недостатком этого варианта секвенирования ДНК посредством гибридизации, известного также как формат 1, является необходимость очень большого числа повторных операций по гибридизации нуклеиновых кислот и прочих необходимых при этом процедур. Следует отметить, что в упоминавшихся работах этих авторов в качестве метки использовался радионуклид 32Р. В недавней работе другими исследователями было применено уже мультиплексное секвенирование ДНК посредством гибридизации, ставшее возможным за счет использования в качестве метки стабильных изотопов олова с различными массовыми числами, позволяющими произвести их отдельную регистрацию при помощи ионизационной масс-спектрометрии [Arlinghaus et al., 1997a]. Однако такой мультиплексный подход, несмотря на свое удобство, все же лишь незначительно решает проблему многочисленных ДНК/ДНК-гибридизаций.