Секвенирование днк без электрофоретического разделения

Определение "Секвенирование днк без электрофоретического разделения" в ЭБНБ

Известно, что сканирующий туннельный микроскоп позволяет получать изображения молекул ДНК с высоким разрешением [Beebe et al., 1989; Briscoll et al., 1990]. Так, в литературе описана экспериментальная схема секвенирования протяженных фрагментов ДНК с его помощью [Kelson, Nussinov, 1994]. В основе предложенного метода лежит синтез комплементарной цепи ДНК, где один из дНТФ в реакционной смеси представлен исключительно в меченном виде, причем высокоэнергетическим радионуклидом 32Р. Таким образом, первая стадия подготовки препарата ДНК к секвенированию заключается в параллельном проведении 4 реакций с разным типом меченых нуклеотидных оснований в каждой. Далее, вновь синтезированные цепи ДНК сорбируются на соответствующую подложку и идет период ожидания, необходимый для полного распада короткоживущего радионуклида 32Р и превращения его в стабильный изотоп 32S. Образовавшиеся атомы серы не могут умещаться в места, оставленные им атомами фосфора, что приводит к разрыву цепи ДНК и образованию набора коротких участков, ограниченных в каждом типе реакций соответствующими нуклеотидами. Авторы считают, что определение линейных размеров (что позволяет перейти к числу азотистых оснований в цепи) таких коротких участков ДНК с помощью сканирующего туннельного микроскопа и сравнительный компьютерный анализ теоретически могут позволить восстановить нуклеотидную последовательность анализируемой молекулы ДНК.

Весьма интересны 2 недавно предложенных метода секвенирования ДНК с использованием рестрикционных эндонуклеаз класса IIS, расщепляющих последовательности ДНК вне своего сайта узнавания [Jones, 1997]. Суть данных методов заключается в по-шаговом секвенировании единичных нуклеотидов с помощью лигирования секвенируемого фрагмента ДНК (предварительно расщепленного этим же ферментом) с набором специальных адапторов, несущих сайт узнавания используемой рестрикционной эндонуклеазы, а также три неспаренные вырожденные нуклеотида на 5'-конце. В результате инкубации секве-нируемой матрицы на предшествующем этапе в растворе ддНТФ, несущих метку в виде 33Р или в виде флуоресцентных красителей (различных для каждого типа оснований) и последующего распознавания включившегося определенного ддНМФ (или флуорометрией, или с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика) происходит сдвиг "чтения" дальнейших нуклеотидов. Циклический характер подобного секвенирования позволяет, таким образом, осуществлять по-шаговое "чтение" очередных нуклеотидов и определять последовательность до 150 нуклеотидов длиной за достаточно короткий промежуток времени. Проведенные автором подсчеты показали теоретически очень высокую производительность данного метода при условии проведения всех процедур в микропланшетах с 384 лунками. Она может еще более возрасти при использовании биочипового формата в сопровождении с соответствующим детектором.

Целая серия статей посвящена способу ферментативного секвенирования ДНК, где электрофоретическое разделение продуктов терминирующих реакций заменено их детекцией с помощью масс-спектрометрического метода (matrix assisted laser desorption/ionization или иначе MALDI) [Tang et al., 1994, 1995; Fu et al., 1996; Koster et al., 1996; Roskey et al., 1996; Xy et al., 1997; Berkenkamp et al., 1998]. Однако следует признать, что несмотря на сложность самого приборного оснащения, секвенировать удается обычно не более 40-50 нуклеотидов. Таким образом, данный подход для секвенирования de novo не пригоден и может использоваться, например, для диагностических целей или генотипирования [Laken et al., 1998]. В то же время справедливости ради следует отметить, что имеется единичное сообщение, где авторам удалось с помощью данного метода детектировать 500 нуклеотидов [Tang et al., 1994].