Секвенирование днк синтезом комплементарной цепи

Определение "Секвенирование днк синтезом комплементарной цепи" в ЭБНБ

Секвенирование ДНК BASS-способом

Другой, пока только теоретически существующий способ определения нуклеотидной последовательности ДНК без применения секвенирующего гель-электрофореза, названный авторами BASS (Base Addition Sequencing Scheme), основан на использовании особого рода терминаторов цепи ДНК, которые под действием УФ-света или какого-либо другого воздействия теряют блокирующую дальнейший синтез ДНК-группу и, таким образом, рост цепи ДНК возобновляется [Metzker et al., 1994]. На рис. показана принципиальная схема такого способа секвенирования ДНК.

В BASS-способе олигонуклеотидный праймер сорбирован на твердом носителе и после отжига на нем секвенируемого фрагмента ДНК под действием ДНК-полимеразы осуществляется понуклеотидный циклический синтез новой комплементарной цепи ДНК. К особенностям такого секвенирования ДНК путем синтеза новой цепи ДНК следует отнести отсутствие какой-либо радиоактивной или флуоресцентной метки у праймера, а также отсутствие в реакционной смеси стандартных субстратов для ДНК-полимераз, каковыми являются дНТФ. Таким образом, новосинтезируемая цепь ДНК формируется исключительно из модифицированных по 3'-концу дНТФ. Детекция очередного присоединенного нуклеотида и его определение происходят спектроскопически за счет того, что специфические модифицированные дНТФ должны нести (теоретически) уникальные блокирующие группы для каждого типа азотистых оснований, позволяющих осуществить их достоверное распознавание. После этапа депротекции под действием УФ-света дальнейший синтез цепи возобновляется и присоединяется очередной тот или иной комплементарный нуклеотид. Последовательное циклическое проведение всех этих стадий позволит (теоретически) определить нуклеотидную последовательность секвенируемой матрицы ДНК. Аналогичная схема секвенирования ДНК путем временного прерывания и дальнейшего возобновления синтеза комплементарной цепи ДНК была предложена и другими авторами [Canard, Sarfati, 1994]. В данной работе была синтезирована серия 2'-дезоксирибонуклеотид трифосфатов (дАТФ, дГТФ, дТТФ и дЦТФ), у которых остаток гидроксила в 3' -положении дезоксирибозы был замещен производными антранила, причем с отличающимися спектрами эмиссии для каждого типа азотистых оснований, давая, таким образом, возможность их регистрации. Было показано, что эти соединения с достаточно высокой эффективностью могут служить субстратами для различных ДНК-полимераз при построении новой цепи ДНК. Так, после распознавания включенного модифицированного дНМФ и его регистрации проводилась обработка 0,1М NaOH с последующей нейтрализацией и синтез комплементарной цепи ДНК возобновлялся. Однако, к сожалению, в отличие от УФ чувствительного 3'-O-(2-нитробензил)-дАТФ, описанного выше, здесь для дальнейшего удлинения праймера требовалось больше усилий и дополнительные стадии в виде добавления различных химических реагентов. Некоторой альтернативой химической депротекции может быть, как сообщают авторы, ферментативная обработка с помощью какой-либо специфичной эстеразы, также способной удалить блокирующую флуоресцентную группу.