Секвенирование днк детекцией днмф

Определение "Секвенирование днк детекцией днмф" в ЭБНБ

Секвенирование ДНК детекцией дНМФ

Еще один метод секвенирования ДНК, не требующий электрофоретического анализа продуктов реакции, основан на детекции флуоресцентно меченных дНМФ с помощью проточного цитофлуориметра [Jett et al., 1989; Davis et al., 1991; Harding, Keller, 1992]. Основная идея метода заключается в детекции меченных разными флуоресцентными группами дНМФ, последовательно отщепляемых с 3'-конца молекулы ДНК под действием экзонуклеазы. Как можно видеть из несколько упрощенной схемы этого метода, приведенной на рис., первым этапом является построение комплементарной цепи ДНК по существующей матрице с использованием в качестве затравки биотинилированного праймера. Главной особенностью этого процесса является включение в растущую цепь ДНК дНМФ, несущих различные флуоресцентные метки (для каждого типа оснований - своя метка). После денатурации ДНК и сорбции новосинтезированной цепи, несущей молекулу биотина на магнитные частицы со стрептавидином, и тщательного удаления ингредиентов первой реакции следует процесс последовательного отщепления по-разному меченных дНМФ с 3'-конца секвенируемого фрагмента ДНК под действием экзонуклеазы и их детекция с помощью проточного флуориметра. Чередование типов флуоресцентной метки, соответствующих разным нуклеотидам и улавливаемых данным прибором после возбуждения лазерным лучом, позволяет определить первичную структуру секвенируемого фрагмента ДНК.

Несмотря на привлекательность этого подхода к секвенированию ДНК, он имеет ряд недостатков. К главным из них можно отнести требование присутствия в реакционной смеси новосинтезированных цепей ДНК, характеризующихся одинаковым 3'-концом. Так, если во всех остальных методах ферментативного секвенирования ДНК непременным условием являлся гомогенный 5' -конец, то здесь роль "первого" нук-леотида отводится находящемуся на У -конце. Причем получение молекул ДНК с гомогенным 5'-концом, принадлежащим в большинстве случаев олигонуклеотидным праймерам, даже несколько проще. Гомогенный же У -конец должен образоваться в результате ферментативного действия высокопроцессивной ДНК-полимеразы при построении новой комплементарной цепи ДНК, да еще и состоящей из одних флуоресцентно меченных нуклеотидов, что может заметно снижать эффективность работы фермента.

К достоинствам метода авторы относят его высокую скорость, поскольку экзонуклеаза отщепляет нуклеотиды со скоростью 100-1000 нуклеотидов/с. Другой важной чертой является возможность секвенирования весьма крупных молекул ДНК, не прибегая к необходимости получения субклонов отдельных фрагментов, однако, чем крупнее фрагмент, тем больше вероятность присутствия значительного количества более коротких участков ДНК с различными гетерогенными 3'-концами. Усовершенствование приборов детекции и повышение их чувствительности, обнаруженные новые ДНК-полимеразы и экзонуклеазы заставляют авторов с оптимизмом смотреть в будущее [Roslaniec et al., 1997].