Пиросеквенирование днк

Определение "Пиросеквенирование днк" в ЭБНБ

Секвенирование ДНК ELIDA-методом

Метод пиросеквенирования ДНК основан на многошаговой детекции неорганического пирофосфата, образующегося из дНТФ (или ддНТФ) в процессе присоединения ДНК-полимеразой соответствующего нуклеотидмонофосфата к 3'-концу растущей цепи ДНК, иммобилизованной на твердом носителе [Ronaghi et el., 1998]. Чтобы понять принцип работы данной системы, в основе которой лежит разработанный ранее метод детекции полимеразной активности через анализ высвобождающегося пирофосфата в режиме реального времени [Nyren, Lundin, 1985; Nyren, 1987], видимо, вполне уместным будет приведение схемы последовательно протекающих ферментативных реакций:

Минисеквенирование ДНК

ДНК-полимераза
(dNMP)_n + dNTP → (dNMP)_n+1 + РР_i
АТФ-сульфурилаза
PP_i + APS → ATP + SO^2-₄
Люцифераза
ATP + люциферин + O₂ → AMP + PP_i + оксилюциферин + CO₂ + hv
где, (dNMP)_n - ДНК, а п - число нуклеотидных остатков, PP_i - неорганический пирофосфат, APS - аденозин 5'-фосфосульфат, hv - квант света.

Этапы пиросеквенирования ДНК

Как видно из приведенной серии последовательных реакций, образующийся в процессе присоединения очередного нуклеотида неорганический пирофосфат затем под действием АТФ-сульфурилазы преобразует аденозинфосфосульфат в молекулу АТФ, которая, в свою очередь, необходима для осуществления ферментативной реакции окисления люциферина люциферазой с выделением квантов света.

В основе секвенирования ДНК, названной авторами ELIDA (Enzymatic Luminometric Inorganic pyrophosphate Detection Assay), лежит та же схема ферментативных реакций, предполагающая последовательные присоединения очередных дНТФ и детекцию высвобождающихся пирофосфатов. Затем неорганический пирофосфат под действием АТФ-сульфурилазы превращается в АТФ и уже молекулы АТФ детектируются с помощью люциферазы жука светлячка, однако было обнаружено, что замена дАТФ его тиопроизводным значительно снижает нежелательный фон, поскольку ДНК-полимераза способна использовать дАТФосБ в качестве субстрата, а люцифераза - нет [Ronaghi et al., 1996].

Как можно видеть из приведенной на рис. схемы секвенирования ДНК посредством понуклеотидного синтеза комплементарной цепи, правильнее говорить не о цикличном характере данного процесса, а скорее как о развивающемся по спирали. К такому выводу можно прийти ввиду того, что каждый (почти каждый) новый цикл начинается с молекулы ДНК, отличающейся от таковой в предыдущем цикле на один или более нуклеотидов.

Ранее этими же авторами был предложен несколько отличающийся подход, названный ими минисеквенированием (рис.) [Nyren et al., 1993]. Его особенностью было то, что на первом этапе в реакционной смеси присутствовали только ддНТФ, каждый в своей пробирке. Второй этап заключается в удлинении комплементарной цепи ДНК в тех пробирках, где не произошло включения ддНМФ. За счет этого достигалось значительное увеличение сигнала, поскольку при этом происходило включение сразу нескольких или даже многих дНМФ. Тип нуклеотида, находящегося в матрице сразу после праймера, определялся по тому, в какой из пробирок не происходило образование на второй стадии пирофосфата. В качестве контроля этого процесса вводились на первой стадии две дополнительные пробирки со всеми четырьмя ддНТФ одновременно и всеми дНТФ соответственно. Определив таким образом первый нуклеотид, приходилось готовить новые пробирки с добавлением в них этим же дНТФ, удлинять праймер и уже затем проводить опять все описанные выше процедуры по выявлению каких-либо трех невключенных в синтезируемую цепь ДНК ддНТФ.

Даже простое перечисление всех этих этапов само за себя говорит о невероятной громоздкости данной процедуры. В связи с этим авторы говорят о применении этого метода исключительно для выявления предполагаемых мутаций и единичных различий между разными образцами ДНК с заранее известной последовательностью. Более простой подход для выявления замен отдельных нуклеотидов, основанный также на детекции в режиме реального времени образовавшегося пирофосфата, был предложен ими позже [Nyren et al, 1997]. Суть его заключается в использовании двух праймеров, отличающихся своими дистальными нуклеотидами на 3'-конце, что позволяет наблюдать или не наблюдать удлинение цепи ДНК из-за образования или не образования спаренных нуклеотидов на 3'-конце праймера с матрицами ДНК соответственно. Главным условием правильного проведения этого процесса является использование ДНК-полимеразы, не обладающей 3' → 5'-экзонуклеазной редактирующей активностью, способной удалить неспаренные нуклеотиды, что привело бы к недостоверному результату.

В своих предыдущих работах эти авторы использовали в качестве ДНК-полимераз ферменты с отсутствием экзонуклеазных активностей - секвеназу, версия 2.0 и Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I, экзо-. Недавно они успешно применили эту технику и для РНК-зависимой ДНК-полимеразы - ревертазы вируса миелобластоза птиц [Karamohamed et al., 1998].

Однако наибольший интерес вызывает работа этих авторов, где ими сделаны существенные улучшения процесса секвенирования ДНК ELIDA-методом, что дало им основания и назвать новый подход пиросеквенированием ДНК [Ronaghi et al., 1998]. Так, в цитируемой работе в описанную выше схему было введено важное дополнение в виде нового фермента - апиразы, деградирующего нуклеотидтрифосфаты. Таким образом, в пиросеквенировании ДНК теперь задействовано 4 фермента (рис.). Роль первых трех известна, а апираза же позволяет автоматизировать этот процесс, удаляя между циклами избыток как образующихся в процессе реакции пирофосфоролиза молекул АТФ, не задействованных люциферазой, так и не включившихся в растущую цепь ДНК дНТФ. За счет этого не требуется проведения трудоемкого и отнимающего значительное время этапа промывки с целью удаления упомянутых выше нежелательных ингредиентов.

Авторы сообщают о созданном ими автоматическом инструменте для пиросеквенирования ДНК, позволяющем проводить одновременный анализ большого числа образцов с минимальным ручным трудом. К недостаткам метода можно отнести его не очень высокую производительность, а также некоторые трудности секвенирования гомополи-мерных участков, где происходит одновременное (в течение одного цикла) включение более чем одного одинакового дНМФ. Причиной последнего является непропорциональное увеличение свечения при включении подряд двух и более одинаковых нуклеотидов, однако, как считают сами авторы, специальная компьютерная программа могла бы в значительной мере снять эту проблему.

Справедливости ради следует отметить, что, основываясь на ранних работах этой группы авторов [Nyren, Lundin, 1985; Nyren, 1987], другим экспериментатором была предложена и осуществлена несколько отличающаяся схема секвенирования ДНК путем детекции пирофосфата в режиме реального времени [Hyman, 1988]. Одним из главных отличий было то, что в предложенном им способе реакции протекали не в растворе, а в стеклянном капилляре, представляющем собой одновременно хроматографическую колонку и реакционный сосуд, где ДНК и ферменты были иммобилизованы на трезил-сефарозе 4В. Другим новшеством было добавление к ДНК-полимеразе, АТФ-сульфурилазе и люци-феразе еще двух ферментов - глицерокиназы и гексокиназы, с помощью которых удалялось обычно всегда присутствующее в препаратах аденозинфосфосульфата загрязняющее количество АТФ путем превращения последнего в АДФ, что заметно снижало уровень "шумов". Модельный эксперимент по секвенированию поли(дА • дТ) позволил выявить ряд нюансов при использовании данного метода. Так, была показана линейная зависимость увеличения свечения при одновременном (за один этап) включении нескольких одинаковых нуклеотидов и соответственно увеличенной концентрации высвобождающегося при этом пирофосфата, но при относительно низком количестве иммобилизованной люциферазы. Отрицательным моментом такой линейности явилась более низкая чувствительность самого метода.