Разделение продуктов терминирующих реакций в автоматическом секвенировании днк

Определение "Разделение продуктов терминирующих реакций в автоматическом секвенировании днк" в ЭБНБ


Принцип автоматического флуоресцентного секвенирования ДНК заключается в электрофоретическом разделении специфически терминированных продуктов секвенирующих реакций, несущих подходящую флуоресцентную метку, и их детекции в режиме реального времени в нижней части геля после возбуждения молекул красителя лазерным лучом в момент прохождения фрагментов ДНК, их содержащих, через эту зону. Существуют различные схемы проведения терминирующих реакций и последующего разделения продуктов в секвенирующем гель-электрофорезе. Так, довольно обычным, типичным и для не автоматического секвенирования, является вариант проведения 4 типов терминирующих реакций с последующим разделением продуктов также в четырех дорожках. Другой вариант (4 реакции/1 дорожка) заключается в проведении также 4 типов реакций с использованием флуоресцентных меток с различными спектрами эмиссии, и поскольку в этом случае их разделение возможно в одной дорожке геля, то это экономит гелевое пространство и, таким образом, сразу в 4 раза повышается производительность данного метода. Более редкими вариантами являются 1 реакция/1 дорожка и 2 реакции/2 дорожки. Эти последние варианты основываются на построении комплементарной цепи ДНК в условиях терминации с помощью секвеназы с использованием какой-то одной флуоресцентной метки, но с различными соотношениями ддНТФ, что позволяет осуществить определение конкретных нуклеотидов по высоте пиков флуоресценции, принадлежащих терминированным этими ддНМФ фрагментам ДНК (Ansorge et al., 1989, 1990; Tabor, Richardson, 1990; Chen et al., 1992].


Первое сообщение об автоматическом секвенировании ДНК с использованием флуоресцентной метки пришло из лаборатории Л. Худа [Smith et al., 1986]. В этой работе после проведения 4 типов реакций (по числу азотистых оснований) с по-разному меченными праймерами продукты всех реакций объединялись и проводилось их разделение в одной колонке полиакриламидного геля. Таким образом, характер разделения оказался - 4 реакции/1 дорожка. За счет разных длин волн флуоресценции использованных соединений (флуоресцеин, NBD, тетраметилродамин и техасский красный) и специального вращающегося колеса с 4 фильтрами в виде секторов была определена последовательность нуклеотидов, разделенных в одной дорожке. Созданный в процессе выполнения этой работы прибор был впоследствии усовершенствован и стал поставляться фирмой "Applied Biosystems, Inc." Несколько отличающийся принцип сбора информации о нуклеотидной последовательности в виде пиков флуоресценции был положен в основу секвенатора ДНК, выпускавшегося в течение ряда лет фирмой "Du Pont" (США). Еще один тип флуоресцентных секвенаторов, разделяющих молекулы ДНК в пластинах полиакриламидного геля и не имеющих подвижных частей, был представлен моделью EMBL (Германия), а также прибором, производимым фирмой "Hitachi" (Япония) и A.L.F. секвенера ("Pharmacia", Швеция), созданного на основе прибора EMBL. В новом поколении этих приборов (EMBL-2) в дополнении к стандартному аргоновому лазеру добавился гелий-неоновый лазер. Высокопроизводительные секвенаторы выпускаются фирмой "Applied Biosystems, Inc.", ставшей дочерней компанией фирмы "Perkin-Elmer". Новая модель 377 DNA Sequencer, пришедшая на смену моделям 373 и 370А, с высокой эффективностью позволяет осуществлять одновременное разделение 96 образцов ДНК. Также довольно производительными приборами являются модели 4000LS Long ReadIR и 4000S фирмы "LI-COR" (США), способные разделять до 800 и 550 нуклеотидов соответственно с точностью 99%. Особенностью последних приборов является то, что в отличие от остальных они основаны на детекции молекул ДНК, меченных красителями, флуоресцирующими в области спектра, близкой к инфракрасной.



Перечисленные выше автоматические системы флуоресцентного секвенирования ДНК высокопроизводительны, сложны и весьма дороги. Недавно фирма "Visible Genetics, Inc." (США) выпустила на рынок новый, менее дорогой прибор OpenGene, не рассчитанный на крупномасштабное секвенирование ДНК, но тем не менее позволяющий осуществить разделение 500 нуклеотидов одного образца за 30 мин с точностью около 98%. Однако всего 16 дорожек в пластине геля, заливаемой и полимеризуемои с помощью специальных устройств всего за 6 мин, не позволяет использовать этот прибор для целей секвенирования полных геномов организмов и поэтому основное предназначение этой системы - это диагностическое секвенирование и анализ полиморфизма генов. В то же время возможность объединения до 4 таких приборов в блок с единым контролем позволяет соответственно увеличить количество секвенируемых матриц.


У российских ученых некоторая надежда на появление отечественного автоматического секвенатора ДНК возникла после объявленного в конце октября 1998 г. тендера по межведомственной научно-технической программе "Научное приборостроение", где в качестве одного из заданий указана разработка и изготовление прибора для секвенирования (Здесь использована орфография, как она была подана в "Перечне заданий" данной Программы. В этой связи следует отметить, что хотя такое произношение и написание этого термина иногда встречается и даже более созвучно с оригиналом, все же в русском языке уже прочно устоялось написание данного слова, как и производных от него, через букву "е". В качестве дополнительного примера можно привести аналогичное написание другого немного похожего и ставшего недавно печально известным многим нашим согражданам термина "секвестр", в котором также пишется и произносится буква V) и анализа ДНК, причем оговоренный срок исполнения заказа составляет не более двух лет.


Постоянно продолжается работа над усовершенствованием систем для автоматического секвенирования ДНК. Так, недавно предложено использование оптоволоконной техники для подачи возбуждающего луча лазера и сбора сигналов флуоресценции, что позволило исключить применение многочисленных зеркал и линз, требующих весьма частой настройки, причем всей системы сразу [Trost, Guttman, 1998]. В случае же использования оптических волокон настройка каждой части может осуществляться независимо. Более того, в своей статье авторы сообщают, что используемые ими около 6 мес подобные системы не потребовали в этот период какой-либо дополнительной регулировки.


Следует отметить весьма заметное увеличение числа "читаемых" нуклеотидов с одной матрицы ДНК при ее разделении с помощью более совершенных моделей флуоресцентных автоматических секвенаторов. Так, если первые приборы позволяли эффективно разделять лишь 300-400 нуклеотидов [Ansorge et al., 1986], в первой половине 1990-х -1000 нуклеотидов [Grothues et al., 1993; Zimmermann et al., 1994], то сейчас в руках этих же авторов подобные величины уже не являются пределом. Ими сообщается о секвенировании матрицы в 2000 нуклеотидов в одну реакцию [Voss et al., 1997]. Ранее этой же группой авторов было продемонстрировано эффективное высокоскоростное разделение флуоресцентно меченных фрагментов ДНК с использованием ультратонкого геля (100 мкм), что позволило увеличить градиент напряжения до 80 В на см длины геля и разделить за 1 ч до 1200 нуклеотидов [Stegemann et al., 1991]. Влияние различных факторов на эффективное разделение флуоресцентно меченных фрагментов ДНК было проанализировано в работах японских авторов [Nishikawa, Kambara, 1991, 1992]. Они пришли к выводу, что лучшие разделения фрагментов ДНК отмечаются при оптимальном соотношении градиента напряжения и толщины геля.


Важным аспектом флуоресцентного автоматического секвенирования ДНК является его высокая чувствительность. При осуществлении крупномасштабных проектов с целью уменьшения их стоимости большое значение приобретает экономия различных ингредиентов секвенирующих реакций, да и матрицы ДНК иногда доступны в довольно ограниченных количествах. В этой связи весьма актуальна работа японских авторов, в которой было показано, что всего 1 фмоль матрицы на основе фага М13 и 0,001 единицы ферментативной активности секвеназы 2.0 оказались достаточными для успешного секвенирования приблизительно 400 нуклеотидов клонированного фрагмента ДНК с помощью автоматического флуоресцентного секвенатора [Kawamoto et al., 1994]. Taq ДНК-полимеразе "потребовалось" 0,45 фмоль матрицы и 0,01 единицы фермента, чтобы "прочитать" приблизительно такое же количество нуклеотидов. В другой работе сообщается о секвенировании менее 100 нг двуцепочечной матрицы в автоматическом флуоресцентном секвенаторе, позволившем осуществить "прочтение" более 700 нуклеотидов [Beg, Holt, 1997]. Сообщается также об ином подходе к более экономному автоматическому секвенированию ДНК, заключающемся в повторном (до четырех раз) использовании одной и той же пластины полиакриламидного геля [Swerdlow et al., 1994]. Авторы обнаружили, что гели с формамидом в качестве денатурирующего агента больше подходят для повторного использования по сравнению с содержащими мочевину. Ухудшение качества электрофоретического разделения в таких повторных экспериментах сильно зависело от присутствия значительных количеств остающихся высокомолекулярных матриц ДНК.


Главной целью любого секвенирования ДНК (как ручного, так и автоматического) является определение последовательности нуклеотидов исследуемого фрагмента ДНК. Как это происходит при ручном секвенировании, уже было описано в главах 4-6. Что касается флуоресцентного секвенирования, этот процесс здесь также автоматизирован, поскольку автоматические секвенаторы ДНК управляются специально написанными программами. Так, например, приборы фирмы "Applied Biosystems, Inc." комплектуются двумя программами сбора и анализа данных. После завершения электрофоретического разделения предварительные данные, собранные программой Data Collection, подвергаются анализу специальной программой, нормализующей промежутки между пиками, соответствующими фрагментам ДНК, терминированным тем или иным типом нуклеотидного основания, определяющей относительную высоту таких пиков и ликвидирующей некоторые другие погрешности [Hagemann, Kwan, 1997a, b]. В то же время следует отметить, что в литературе имеются сообщения об аналогичных программах, обеспечивающих даже большую точность в определении конкретных нуклеотидов при сборе и анализе этой информации при разделении фрагментов ДНК в приборах этой же фирмы [Ewing et al., 1998; Ewing, Green, 1998]. Ранее была написана программа Ted (Trace editor), допускающая сбор первичных данных и их анализ с помощью автоматических секвенеров той же фирмы "Applied Biosystems, Inc.", а также A.L.F. секвенера фирмы "Pharmacia" [Gleeson, Hillier, 1991]. Для автоматических секвенеров этих фирм была написана и другая программа, позволяющая легко обращаться с весьма протяженными последовательностями ДНК при выполнении крупномасштабных проектов [Dear, Staden, 1991]. В другой своей работе этими авторами было уделено серьезное внимание точности определения конкретных нуклеотидов на этапе анализа первичного материала, получаемого с помощью секвенеров 373А и A.L.F. все тех же фирм [Bonfield, Staden, 1995]. Сообщалось, что искажение формы полос разделяемых фрагментов ДНК размером свыше 400 нуклеотидов приводило к нечеткой регистрации соответствующих им пиков и, как следствие, к большему числу ошибочно определяемых нуклеотидов [Sanders et al., 1991]. Разработанная этими авторами компьютерная программа, способная генерировать изображение полос ДНК, позволила повысить точность секвенирования и увеличить длину секвенируемого фрагмента ДНК.


Многие компьютерные программы, рассчитанные на сбор первичных данных при автоматическом секвенировании ДНК, к сожалению, учитывают только информацию о высоте пиков флуоресценции, приходящихся на конкретный нуклеотид. С целью повышения достоверности определяемых этим методом нуклеотидных последовательностей было предложено принимать в расчет не только пики, а также впадины между ними, но и формы кривых, их формирующих [Allex et al., 1996]. Этими авторами и пикам и впадинам, исходя из их характера, были присвоены свои классификации, как сильный(ая), средний(яя) и слабый(ая). Разработанная программа, позволяющая обрабатывать первичный материал в виде пиков флуоресценции секвенируемой ДНК при ее разделении в автоматическом секвенаторе ABI 377, оценивала все эти параметры. Так, было показано, что при "чтении" конкретных нуклеотидов в виде принадлежащих им пиков флуоресценции и с учетом впадин от других нуклеотидов, совпадающих по месту с этими пиками, заметно повышается точность секвенирования. Другим важным аспектом предложенного разложения записи сигналов флуоресценции секвенируемой ДНК, также способствующего повышению достоверности и производительности данного метода, является возможность более корректного удаления концевых последовательностей перед этапом состыковки различных фрагментов в единый блок. Ряд программ предполагает весьма жесткую установку самим экспериментатором предела чтения, например в 500 нуклеотидов, после которого часто заметно увеличивается процент неверно определяемых нуклеотидов. Другая существующая возможность удаления сомнительных данных предполагает подсчет в специальном окне (составляющем обычно до 40-50 нуклеотидов) неоднозначно определяемых нуклеотидов, и после достижения установленной пороговой величины такие сведения в дальнейший анализ уже не берутся. Однако и во втором, и, особенно, в первом случае есть вероятность как взятия в анализ недостоверных сведений, так и отбрасывания тех, которыми можно было бы воспользоваться. В связи с этим в подобных участках обычно рекомендуется визуальный анализ записи флуоресцентных сигналов, что при большом объеме секвенирования становится мало реальным. Разложенные на составляющие кривые флуоресценции позволяют провести более точную дискриминацию данных, пригодных для дальнейшего анализа от неверных. Следует отметить, что все описанные возможности сбора и анализа первичного материала реализованы в модуле Seqman II (более подробно о котором речь пойдет в следующей главе) фирмы "DNASTAR, Inc." (США), что отличает его от аналогичных программ других фирм [Allex et al., 1997]. Серьезное значение в автоматическом секвенировании ДНК приобретает точность определения нуклеотидной последовательности, поскольку в большинстве случаев экспериментатор не участвует в процессе ее "чтения" и занесения в компьютер. Проводились специальные сравнения числа "ошибок", производимых различными ДНК-полимеразами. Так, в одной работе секвенировали 94 фрагмента ДНК протяженностью 501 пн с использованием секвеназы и Taq ДНК-полимеразы [Rolfs, Weber, 1994]. Авторы сообщают, что при секвенировании отрезка до 300 нуклеотидов уровень ошибок составлял для секвеназы 0,3%, а для Taq ДНК-полимеразы - 1%, однако после 350 нуклеотида количество ошибок резко возрастало для обоих ферментов и варьировало от 6 до 20%. Следует отметить еще одну работу, где была достигнута довольно высокая точность секвенирования, превышающая 99% для нескольких фрагментов ДНК со средней длиной 461 нуклеотид, однако больший интерес к себе она вызывает тем, что в качестве затравочных молекул авторами использовался 31 модульный праймер, составленный каждый из трех различных гексамерных блоков [Lodhi, McCombie, 1996]. С использованием такого же составного (из гексамеров) праймера были секвени-рованы одноцепочечные матрицы со средней длиной "прочитанного" участка 393 нуклеотида и точностью 99,6% [Hou, Smith, 1994]. Двуцепочечные матрицы характеризовались несколько худшей точностью (99,4%) при средней длине секвенированных фрагментов в 367 пн. Есть работы, в которых сообщается о секвенировании 700-750 нуклеотидов с точностью более чем 98,5% [Beg, Holt, 1997]. Более высокая точность (99,7%) при секвенировании отрезка в 700 нуклеотидов была достигнута в работе других авторов [Grothues et al., 1993].


Секвенирование ДНК с использованием четырех различных флуоресцентных красителей используется чрезвычайно широко и целая серия статей была посвящена особенностям регистрации их свечения и некоторой коррекции получаемых данных, имеющих целью повысить эффективность и достоверность секвенирования [Yin et al., 1996; Huang et al., 1997,1998]. В работе других авторов описана многофункциональная компьютерная программа, рассчитанная в том числе на сбор первичной информации при секвенировании ДНК в системе с четырьмя красителями и ее дальнейшую обработку [Wendl et al., 1998].


Некоторую опасность потери информации о секвенируемой матрице ДНК представляет возможный сбой в работе компьютера непосредственно в момент секвенирования. Поскольку при автоматическом флуоресцентном секвенировании занесение предварительных данных в компьютер происходит одновременно с разделением, такой сбой может привести к утере значительной части данных. Для спасения такой информации была разработана специальная программа, восстанавливающая потерянные данные при секвенировании ДНК с помощью секвенаторов моделей 373 и 377 [O'Brien et al., 1997]. Причем авторы сообщают о возможности бесплатного предоставления этой программы, написанной для компьютера Макинтош.


В автоматическом секвенировании ДНК для разделения флуоресцентно меченных продуктов терминирующих реакций, кроме электрофореза в стандартных пластинах полиакриламидного геля, весьма широко используется и капиллярный гель-электрофорез. Причем, для флуоресцентного капиллярного электрофореза характерна как очень высокая чувствительность, так и высокая скорость разделения, являющиеся следствием крайне малого внутреннего диаметра самого капилляра. Так, сравнение разделяемых количеств ДНК в стандартной пластине геля и капилляре путем экстраполяции показывает, что в последнем случае детектируются количества ДНК, которые бы соответствовали атто-молярным, против обычно детектируемых в какой-либо полосе ДНК фемто-молярных [Drossman et al., 1990; Luckey et al., 1990]. К подобному же выводу приходят и другие авторы [Zagursky, McCormick, 1990]. Сообщается об еще более высокой чувствительности этого метода, позволяющего детектировать цептомолярные количества секвенируемых фрагментов ДНК [Swerdlow et al., 1991]. Высокая скорость разделения, присущая капиллярному гель-электрофорезу, является следствием прилагаемого градиента напряжения, доходящего в отдельных случаях до 428 В на 1 см длины капилляра и позволившего разделить 317 нуклеотидов за 31 мин вместо 452 мин, которые требовались для подобного разделения в стандартном геле [Luckey et al., 1990]. Проведенные несколько позже математические расчеты показали, что время разделения продуктов секвенирующих реакций капиллярным электрофорезом может быть даже еще короче, чем обычно затрачиваемое [Aldroubi, Garner, 1992]. Но, как отмечается в недавнем обзоре Довичи [Dovichi, 1997], сверхвысокая скорость разделения, составившая всего 3,5 мин при градиенте напряжения 1200 В/см, оказалась малопригодной для геномного секвенирования и может лишь использоваться в экспериментах, связанных с повторным секвенированием (например, в диагностических исследованиях). Более того, количество определяемых нуклеотидов и скорость разделения находятся в обратной зависимости. Таким образом, увеличение производительности метода капиллярного электрофореза было достигнуто не снижением времени разделения, а созданием приборов с многочисленными капиллярами, позволяющими параллельно секвенировать большое число образцов ДНК [Xuang et al., 1992a]. Хотя следует отметить, что ввиду имеющего место некоторого разброса в скорости разделения фрагментов ДНК от капилляра к капилляру, предпочтительнее использовать подход 4 реакции/1 дорожка [Xuang et al., 1992b]. Так, сообщается о 4-цветном-1-дорожечном секвенировании в пучке из 25 независимых параллельных капилляров, что обеспечило высокую производительность данной системы [Kheterpal et al., 1996].


Иной подход к увеличению продуктивности метода был продемонстрирован другими авторами [Chen et al., 1992]. Так, проведение терминирующих реакций путем удлинения праймеров, меченных производным флуоресцеина, для ддАТФ и ддЦТФ (взятых в соотношении как 2:1) и меченных производным родамина для ддТТФ и ддГТФ (также взятых в соотношении друг к другу как 2:1) позволило провести их одновременное разделение в одном капилляре и по высоте пиков детектировать конкретный нуклеотид, терминировавший фрагмент ДНК определенной длины и определить, таким образом, последовательность ДНК до 400 нуклеотидов. Дидезокситерминаторы, взятые в реакцию синтеза комплементарной цепи ДНК в соотношении 4:2:1:0 (ddA, ddC, ddG, ddT), позволили разделить терминированные фрагменты в одном капилляре и по высоте пиков флуоресценции, принадлежащим красителю цианинового ряда, "пришитого" к праймеру, определить последовательность около 250 нуклеотидов [Williams, Soper, 1995]. Однако точность секвенирования ДНК при таком подходе составила всего 84%. Более эффективное разделение протяженных фрагментов ДНК было достигнуто с использованием линейных "несшитых" полимеров низкой концентрации в качестве матрикса для капилляров [Ruiz-Martinez et al., 1993], повышением температуры разделения [Kleparnik et al., 1996], приложением оптимальных [Luckey, Smith, 1993; Manabe et al., 1994] или ступенчатых электрических полей [Inoue et al., 1998]. Еще один вариант повышения производительности секвенирующего капиллярного электрофореза за счет использования всего 3 флуоресцентных красителей был недавно предложен в качестве способа мультиплексного секвенирования [Kheterpal et al., 1998]. Однако, как отмечают сами авторы, вряд ли предложенная схема сможет заменить стандартное 4-цветное секвенирование ДНК.


Гелевым матриксом в ранних работах по секвенирующему капиллярному электрофорезу служил обычный полиакриламидный гель, однако связанные с ним проблемы в виде его нестабильности, формирования пузырьков воздуха, видимых при микроскопическом исследовании капилляров, заметно снижали производительность метода [Swerdlow, Gesteland, 1990; Karger et al., 1991; Swerdlow et al., 1992]. Введенный в употребление линейный полиакриламид оказал заметное влияние на последующее развитие этого метода [Ruiz-Martinez et al., 1993]. Кроме уже широко распространенного линейного полиакриламида [Best et al., 1994; Zhang et al., 1995; Wu et al., 1996], в литературе встречаются упоминания об использовании в качестве матрикса мицелл полиэтиленгликоля с фтор-углеродными цепочками [Menchen et al., 1996], полиэтиленоксида [Kim, Yeung, 1997], полиметилакриламида [Madabhushi, 1998] и некоторых других [Quesada, 1997; Beale, 1998]. Новый способ полимеризации линейного 2%-ного полиакриламидного геля и его использование в качестве матрикса при заполнении капилляра позволило за 80 мин разделять более 1000 нуклеотидов с точностью выше 97% и 99%-ной точностью для первых 800 нуклеотидов [Goetzinger et al., 1998]. Считается, что немаловажную роль в ухудшении разделения играют даже незначительные загрязнения матрицы ДНК, как, впрочем, и сама матрица. Так, удаление ненужной уже матрицы с помощью ультрафильтрации через полиэфир-сульфоновую мембрану и снижение концентрации соли до 10 мкМ за счет спин-диализа позволили значительно увеличить эффективность разделения фрагментов ДНК (до 1000 нуклеотидов с точностью 99% для первых 800 нуклеотидов) и продлить срок службы капилляра [Ruiz-Martinez et al., 1998; Salas-Solano et al., 1998].


Особым случаем капиллярного электрофореза можно считать подход, использующий микрокапилляры, изготовленные на плоском стекле с помощью фотолитографии и химического травления и закрытые сверху другим стеклом со специальными микронными отверстиями, проделанными с помощью лазера [Woolley, Mathies, 1994]. После заполнения полученных капилляров линейным полиакриламидным или каким-то другим гелем такие капиллярные "чипы" готовы к электрофоретическому разделению ДНК. В цитируемой выше работе для эффективного разделения рестриктазных фрагментов ДНК с размерами от 70 до 1000 пн на таком чипе с длиной миграции только 3,5 см потребовалось всего 120 с. Следует отметить, что для детекции флуоресценции ДНК в этой работе, кроме всего прочего, потребовался еще и объектив с 40-кратным увеличением. В своей следующей работе эти авторы уже осуществили секвенирование ДНК в таком микрокапиллярном чипе, причем для разделения 433 нуклеотидов в системе с одним красителем (4 реакции/4 дорожки) оказалось достаточно 10 мин [Woolley, Mathies, 1995]. Используя четыре разных красителя (4 реакции/1 дорожка), с 97%-ной точностью за 540 с было секвенировано приблизительно 150 нуклеотидов. В работе других авторов с помощью микрокапиллярного чипа с длиной канала 11,5 см была определена последовательность 400 нуклеотидов за 14 мин [Schmalzing et al., 1998]. Подобные системы секвенирования ДНК в микрокапиллярных электрофоретических чипах имеют целый ряд преимуществ перед другими способами разделения фрагментов ДНК ввиду их чрезвычайно малого размера, сверхвысокой чувствительности, требующей ничтожные количества ДНК в нанолитровых объемах, высокой скорости разделения, превышающей таковую для стандартного капиллярного электрофореза в 10 раз и для электрофореза в пластинах геля в 100 раз. В связи с подобной миниатюризацией процесса следует отметить, что недавно американской фирмой "Packard Instruments" разработана PiezoTip система, позволяющая дозировать жидкости объемом от 0,2 нл, пригодная наряду с дозированием жидкости для различных анализов в микропланшетах с 384, 864 и даже с 1536 лунками, также и для подобных целей.


Интересный способ "чтения" последовательности нуклеотидов после завершения капиллярного электрофореза был предложен в статье Кима и соавт. [Kim et al., 1996]. Так, проведенное ими последовательное сканирование капилляра содержащимися в нем флуоресцентно меченными фрагментами ДНК с помощью специального сканера со скоростью около 8 см/с при разных длинах волн возбуждения лазером позволило детектировать до 200 нуклеотидов плазмидной ДНК.


Высокая чувствительность, высокая скорость разделения продуктов секвенирующих реакций методом капиллярного электрофореза, возможность многократного использования капилляров привели к созданию высокопроизводительных, полностью автоматизированных приборов, таких как например, ABI Prism 310 ("Perkin-Elmer", США). Фирмой "Molecular Dynamics" (США), являющейся дочерней компанией концерна "Amersham Pharmacia Biotech", создана система для секвенирования ДНК MegaBACE®1000, позволяющая проводить параллельное электрофоретическое разделение продуктов терминирующих реакций в 96 капиллярах. Данный прибор осуществляет автоматическое внесение препаратов ДНК, регистрацию данных, способен автоматически заменять гелевый матрикс в капиллярах. Высокая скорость разделения (весь цикл от момента внесения препаратов до следующего внесения занимает всего 2 ч) позволяет секвенировать более 500 тпн в течение суток с гарантированным определением более 500 нуклеотидов на один образец ДНК. Капилляры, объединенные в блоки по 16 штук, позволяют проводить легкую смену гелевого матрикса и рассчитаны на их использование в течение, по крайней мере, 100-200 раз. В сентябре 1998 г. было объявлено, что "Molecular Dynamics" совместно с фирмой "Beckman Coulter" (США), также выпускающей высокопроизводительный секвенер CEQ2000, и известной своими лабораторными работами "Biomek", будет разработан полностью автоматизированный комплекс, который объединит 4 прибора MegaBACE®1000 и увеличит, таким образом, количество секвенируемых последовательностей нуклеотидов до 2 мпн в сутки, причем без участия оператора.
9.4. АВТОМАТИЗАЦИЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ДНК МЕТОДОМ ХИМИЧЕСКОЙ ДЕГРАДАЦИИ ПО МАКСАМУ-ГИЛБЕРТУ


Все описанное выше в этой главе относилось к автоматическому секвенированию ДНК ферментативным методом по Сэнгеру. Что касается секвенирования путем химической деградации по Максаму-Гилберту, то этот метод менее пригоден для его автоматизации. Одной из причин этого являются особенности проведения реакций химической модификации оснований и пиперидинового гидролиза, требующих довольно много стадий при их выполнении. Так, была разработана практически единственная модель робота, производимого фирмой "Seiko Instruments" (Япония), для автоматизации проведения химических реакций при секвенировании ДНК по Максаму-Гилберту. Данный микрохимический робот был способен осуществлять все операции по количественному добавлению необходимых реагентов (в диапазоне от 1 мкл до 1 мл), их перемешиванию, центрифугированию, высушиванию, поддержанию заданных температур во время реакций на основе введенной в него программы без непосредственного участия персонала на всех стадиях [Wada, 1984; Wada et al., 1984]. Подобную автоматизацию, впрочем, было трудно считать высокопроизводительной, поскольку на подготовку к секвенирующему электрофорезу 12 образцов уходило около 12 ч [Wada, 1987].


Исключив из схемы проведения реакций химической деградации этапы центрифугирования, другая группа исследователей смогла автоматизировать этот процесс с помощью ставшего уже к этому времени стандартным лабораторного биоробота Biomek 1000 [Boland et al., 1994]. Вместо трудоемких повторяющихся этапов центрифугирования ими было предложено проводить все химические реакции этого метода секвенирования с препаратами ДНК, сорбированными на стеклянном порошке с завершающей эволюцией уже готовой для электрофоретического разделения ДНК с помощью высокой концентрации NaJ. Определенной автоматизации процесса химической деградации удалось добиться путем твердофазного секвенирования с использованием в качестве носителя для модифицируемой ДНК CCS-бумаги [Hybond M&G], обладающей высокой механической прочностью [Rosenthal et al., 1985; Ansorge et al., 1988; Voss et al., 1989]. Сообщается также об использовании в качестве твердой фазы магнитных частиц при секвенировании флуоресцентно меченных фрагментов ДНК, что позволило упростить процедуры проведения химических реакций [Ohara et al., 1997].


Об использовании автоматического секвенатора ДНК при разделении флуоресцентно меченных фрагментов ДНК, подвергнутых химической модификации и гидролизу, говорится в работе Розенталя и соавт. [Rosenthal et al., 1990]. Так, в системе 4 реакции/4 дорожки, где образцы ДНК готовились с помощью стандартных реакций модификации по Максаму-Гилберту, было достигнуто разрешение, позволяющее осуществить разделение 250-300 нуклеотидов. Электрофоретическое разделение образцов, подготовленных с помощью гидролиза пиперидином в присутствии NaCl (предварительно обработанных диметисульфатом) с характером расщепления G>A>C>T, в системе 1 реакция/1 дорожка позволило секвенировать 100-200 нуклеотидов на образец.




"ЭБНБ" >> "Р" >> "РА" >> "РАЗ"

Статья про "Разделение продуктов терминирующих реакций в автоматическом секвенировании днк" в Энциклопедии БНБ была прочитана 3651 раз
Коптим скумбрию в коробке
Панайпай

TOP 15