Терминирующие реакции при автоматическом секвенировании днк ферментативным методом

Определение "Терминирующие реакции при автоматическом секвенировании днк ферментативным методом" в ЭБНБ

Основными необходимыми ингредиентами при проведении секвенирующих реакций ферментативным методом служат, кроме самих матриц ДНК, затравочные молекулы, ДНК-полимеразы, смеси дНТФ/ддНТФ, меченые молекулы. Что касается затравочных молекул, то в автоматическом секвенировании используются те же олигонуклеотидные праймеры, включая как относительно короткие из нонамерной библиотеки [Bock, Slinghtom, 1995], так и сегментированные гексамерные праймеры [Hou, Smith, 1994; Johnson et al., 1996; Kaczorowski, Szybalski, 1996; Lodhi, McCombie, 1996; Ruiz-Martinez et al., 1996]. Причем в последней работе описывается применение в качестве затравочных молекул гексамерных модулей вместе с SSB-белком и, как отмечают авторы, это было сделано впервые при разделении продуктов терминирующих реакций капиллярным электрофорезом. Хотя следует отметить, что в некоторых работах подчеркивается, что праймеры, используемые в обычном секвенировании ДНК с помощью радиоактивной метки, не всегда пригодны для автоматического секвенирования с применением флуоресцентной метки и требуют более строгого выбора их нуклеотидной последовательности [De Bellis et al., 1990; 1992].

В автоматическом секвенировании ДНК применяются различные высокопроцессивные ДНК-полимеразы. Выбор конкретной из них во многом зависит от температурных особенностей проводимых терминирующих реакций. Следует отметить, что весьма широкое применение для секвенирующих реакций, проводимых с помощью биоробота, находит фермент Bst ДНК-полимераза из-за ее высокой стабильности при комнатной температуре в отличие от секвеназы. Так, в ряде работ показано высокое качество получаемых результатов при использовании этого фермента для проведения секвенирующих реакций с помощью лабораторного робота [Earley et al., 1993; 1994]. В последней работе авторами было проведено сравнение двух ДНК-полимераз - секвеназы и Bst ДНК-полимеразы, причем оказалось, что по прошествии уже 2 ч с момента запуска биоробота качество вновь синтезированных продуктов, образующихся в ходе терминирующих реакций с помощью секвеназы, резко ухудшается, тогда как даже после 4-часовой задержки Bst ДНК-полимераза давала практически схожую картину с реакциями, проводимыми сразу после запуска этого робота. Причиной тому является известная нестабильность секвеназы при комнатной температуре. В то же время имеется много работ, где в качестве ДНК-полимеразы при автоматическом секвенировании использовался именно этот фермент [Kristensen et al., 1988; Toneguzzo et al., 1988; Voss et al., 1990]. Был проведен сравнительный анализ эффективности различных ДНК-полимераз в автоматическом флуоресцентном секвенировании [Voss et al., 1993]. Так, было показано, что наилучшие результаты дает секвеназа, a Bst ДНК-полимераза ей несколько уступает, тогда как термостабильные ДНК-полимеразы (ATaq и Vent(exo-)) характеризовались заметно худшей однородностью пиков ДНК. В этой же работе сравнивалось применение данных модифицированных ДНК-полимераз (секвеназа, ATaq и Vent(exo-)) с их нативными формами в автоматическом флуоресцентном секвенировании и заметных различий при этом авторы не обнаружили. Высота пиков в зависимости от используемых ферментов анализировалась также в работах и других авторов (Parker et al., 1995; 1996]. Так, ими было показано, что высота пиков, приходящихся на фрагмент ДНК с конкретным ддНМФ на его 3'-конце, зависит от предшествующих ему одного-двух нуклеотидов при построении цепи как с помощью обычной Taq ДНК-полимеразы, так и ее модифицированной версии AmpliTaq FS (F667Y), причем последний фермент все же давал более равномерные по высоте пики.

Достаточно трудоемкой операцией, требующей высокой точности исполнения, является проведение терминирующих реакций, которые при массовом автоматическом секвенировании становятся "узким местом". Использование производимых различными фирмами лабораторных роботов, таких как Biomek 1000, Biomek 2000, Biomek SL, Vistra DNA Labstation 625, ABI Prism CATALYST 800, ABI Prism 877, BioRobot 9600 или им подобных, работающих по принципу XYZ (где X - означает передвижение платформы в горизонтальном направлении, a Y и Z указывают на перемещение подвижного плеча робота в другом горизонтальном, а также вертикальном направлениях), смогло резко повысить производительность этого этапа и освободило экспериментатора от большого объема кропотливой работы [Wilson et al., 1988; Zimmermann et al., 1988,1990; D'Cunha et al., 1990; Earley et al., 1994]. При этом следует отметить, что применение термостабильных ферментов потребовало использования специальных блоков, поддерживающих необходимую температуру [Ciora et al., 1991; Earley et al., 1994].

Интересным решением проблемы проведения терминирующих реакций одновременно со многими матрицами ДНК, полученными в ходе ПЦР, и содержащими на одной цепи молекулу биотина, явилось приготовление специальной гребенки и соответствующей ей реакционной подставки с лунками [Parik et al., 1993; Lagerkvist et al., 1994]. Особенностью данной гребенки было то, что ее поверхность была покрыта сефарозой, содержащей, в свою очередь, молекулы авидина, что выполняло роль твердой фазы для биотинилированной цепи ДНК при проведении секвенирующих реакций. Еще одно преимущество этой гребенки заключалось в возможности ее использования при одновременном нанесении образцов ДНК на секвенирующий гель, поскольку форма гребенки соответствовала стандартной, используемой при формировании колодцев геля. Схожий принцип одновременного нанесения большого числа образцов ДНК (до 200), удерживаемых на зубцах гребенки ввиду пористости материала, из которого она была изготовлена, был предложен другими авторами [Erfle et al., 1997]. В литературе сообщается об изготовлении специальных пневматических устройств, позволяющих провести быстрое нанесение препаратов ДНК на секвенирующий гель [Panussis et al., 1998].

Подходы к мечению вновь синтезируемых цепей ДНК в условиях терминации при автоматическом секвенировании отличаются от таковых в обычном ферментативном секвенировании, пожалуй, лишь типом самой метки, которая представляет собой молекулу какого-либо флуоресцирующего соединения. Но если в случае ручного секвенирования выбор меченых соединений, будь то радионуклиды или какие-либо гаптены для нерадиоактивного секвенирования, довольно ограничен, то для автоматического секвенирования уже синтезировано большое число различных флуоресцентных красителей, а также их производных и этот процесс интенсивно продолжается. К основным требованиям, предъявляемым к подобным соединениям, можно отнести, во-первых, высокий квантовый выход при флуоресценции, обеспечивающий в приборах разного типа детекцию фемто-, атто- или даже цептомолярных количеств ДНК. Во-вторых, для мечения разных; азотистых оснований с их последующей детекцией в одной дорожке секвенирующего геля или в одном капилляре используемые флуорофоры должны иметь неперекрывающиеся или незначительно перекрывающиеся спектры эмиссии. В-третьих, весьма желательно, чтобы флуоресцентные красители, используемые для мечения разных нуклеотидов, не сильно различались по своему влиянию на изменение электрофоретической подвижности меченных ими фрагментов ДНК, поскольку в противном случае будет необходима определенная корректировка получаемых первичных данных и вероятность неверного определения последовательности нуклеотидов при этом несколько возрастает. В этой связи следует отметить, что некоторые из синтезированных флуоресцентных соединений лишь незначительно влияют на электрофоретическую подвижность молекул ДНК или делают это в весьма узком диапазоне. Другой подход выравнивания электрофоретической подвижности фрагментов ДНК, меченных подчас весьма объемными соединениями, заключается в присоединении какой-либо из этих меток путем использования в необходимых случаях специальных линкеров, способных сгладить имеющиеся различия. Так, в литературе описан синтез и использование серии из 4 флуоресцентных красителей, получивших наименование BODIPY (boron dipyridil) и характеризующихся улучшенными спектральными характеристиками с меньшей степенью перекрытия между ними [Metzker et al., 1996] по сравнению с использующимися для этих же целей и ставших уже классическими производными флуоресцеина (FAM и JOE) и родамина (TMR и ROX). Другой важной чертой BODIPY красителей, отмечаемой этими авторами, можно считать одинаковую электрофоретическую подвижность фрагментов ДНК равной длины, но несущих разные красители из этой серии, при секвенировании ДНК. В то же время использование различной длины линкеров для присоединения этих красителей к олигонуклеотидным праймерам позволяет изменить их подвижность таким образом, что применяемая компьютерная программа коррекции подвижности для праймеров, меченных стандартными производными флуоресцеина и родамина, может стать пригодной и для BODIPY-олигонуклеотидов. Проведенный анализ подвижности фрагментов ДНК, меченных различными флуоресцентными красителями, при их разделении капиллярным гель-электрофорезом с использованием в качестве матрикса полиэтиленоксида показал, что и в этом случае минимальные отклонения были характерны для BODIPY-олигонуклеотидов [Tan, Yeung, 1997]. Продолжающийся синтез новых более эффективных флуоресцентных красителей приводит к увеличению чувствительности автоматического секвенирования ДНК за счет лучшего квантового выхода этих флуорофоров. Подобное достигается также путем повышения интенсивности флуоресценции за счет передачи энергии от одного красителя к другому, что более подробно рассмотрено ниже.

Несмотря на то, что для автоматического секвенирования ДНК подбираются красители с отличающимися спектрами эмиссии, все же полностью избежать перекрытия не удается. Один подход к решению данной проблемы заключается в синтезе все новых флурофоров с улучшенными спектральными характеристиками. Другой же состоит в недавно предложенном способе детекции не спектра эмиссии конкретного соединения, а времени его флуоресценции, измеряемой в наносекундах [Nunnally et al., 1997]. Так, после анализа различных красителей были выбраны наиболее подходящие для этой цели и в модельном эксперименте продемонстрирована их пригодность для автоматического секвенирования ДНК. Авторы отмечают, что такая характеристика флуорофоров, как продолжительность свечения, более дискретна для большинства красителей, нежели их спектры испускания света. Особую актуальность данный подход приобретает в связи с мультиплексным секвенированием ДНК, где необходимо одновременно разделять несколько по-разному меченных образцов [Не et al., 1998]. Так, другими авторами за счет детекции времени флуоресценции ряда красителей было осуществлено мультиплексное секвенирование ДНК, показавшее точность свыше 90% для 660 нуклеотидов [Lieberwirth et al., 1998].

Для автоматического секвенирования ДНК, как и для обычного, применяют и внутреннее мечение с помощью несущих флуоресцентную молекулу различных дНТФ, и 5'-концевую метку в виде олигонуклеотидного праймера с флуорофором и 3'-концевую метку, образующуюся за счет терминации синтезируемых цепей ДНК ддНМФ, содержащими какие-либо флуоресцентные красители. Так, внутреннее мечение вновь синтезируемой цепи ДНК с помощью флуоресцентно меченных предшественников в виде дНТФ является относительно дешевой альтернативой использованию праймеров с флуорофором [Ansorge et al., 1992]. О квазиконцевом мечении вновь синтезируемой цепи ДНК с помощью или дАТФ, или дУТФ, несущих молекулы флуоресцина, а также ограниченного набора остальных дНТФ сообщается в работе Де Беллиса и соавт. [De Bellis et al., 1995]. Другими авторами было обнаружено заметное изменение эффективности мечения ДНК в процессе построения ее новой цепи с использованием аналогичного флуоресцеинового производного дАТФ, связанное с положениями находящихся в исходной матрице ДНК комплементарных ему остатков тимидина [Wiemann et al., 1995a]. Так, максимальная эффективность мечения отмечалась, если первым включаемым вслед за праймером нуклеотидом являлся именно флуоресцеин-15-дАМФ. В других случаях она снижалась очень заметно, причем чем дальше от праймера мог включаться данный меченый нуклеотид, тем с худшей эффективностью это происходило. Таким образом, авторы пришли к выводу о необходимости подбирать праймеры для секвенирования ДНК праймерной "прогулкой" с таким расчетом, чтобы первым включаемым нуклеотидом был тот, который нес флуоресцентную метку [Wiemann et al., 1996]. Основываясь на данном наблюдении, ими был разработан подход, позволяющий осуществить одновременное флуоресцентное мечение обоих концов ДНК разными производными дНТФ [Wiemann et al., 1995b]. Один из используемой пары праймеров подбирался с таким расчетом, что первым включаемым нуклеотидом был флуоресцеин-15-дАМФ, тогда как после второго праймера должен был включаться техасский красный-5-дЦТФ. Использование автоматического секвенатора с двумя лазерными лучами, возбуждающими тот или иной флуорофор, позволяло осуществлять одновременную детекцию двух типов пиков, принадлежащих разным цепям секвенируемого фрагмента ДНК [Wiemann et al., 1996]. Так, гелий-неоновый лазер возбуждал молекулу техасского красного, а аргоновый лазер - флуоресцеина.

Другую разновидность внутреннего введения метки можно представить как возможность мечения уже самого праймера по его 3'-концу флуоресцеин-15-дАТФ за счет использования 3' → 5'-экзонуклеазной активности нативной Т7 ДНК-полимеразы, способной в отсутствие остальных дНТФ провести обменную реакцию при условии, что концевой нуклеотид праймера будет тот же дАМФ. Добавление различных флуоресцентных красителей к 3'-концу праймера путем его ферментативного удлинения с помощью дУТФ с "пришитыми" флуорофорами показало, что ряд ДНК-полимераз (Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I, обратная транскриптаза и некоторые другие) способны эффективно включать подобные объемные соединения, которые, в свою очередь, не препятствуют дальнейшему синтезу комплементарной цепи ДНК [Александрова и др., 1990]. Упомянутая выше обменная реакция, осуществляемая за счет 3' → 5'-экзонуклеазной активности нативной Т7 ДНК-полимеразы, приводила, по существу, к образованию флуоресцентно меченного по своему 3'-концу олигонуклеотидного праймера. Недавно другими авторами был предложен метод синтеза олигонуклеотидов, несущих различные производные флуоресцеина на своем 3'-конце [Markiewicz et al., 1997]. В этой работе также сообщается, что синтезированные ими праймеры оказались пригодны для проведения секвенирующих реакций и нормально удлинялись секвеназой, что потребовало специальной проверки, поскольку известно, что отдельные флуоресцентные производные дНМФ и ддНМФ различными ДНК полимеразами включаются в синтезируемую цепь ДНК с разной эффективностью и можно было предположить, что и затравочный комплекс с модифицированным нуклеотидом на 3'-конце будет значительно хуже "узнаваться" ДНК-полимеразами. Так, например, известно, что Taq ДНК-полимераза использует нуклеотиды, содержащие молекулы флуоресцеина в качестве субстрата с большей "неохотой", нежели с родамином или другими флуоресцентными группами [Lee et al., 1992]. Отмеченная в другой работе лучшая эффективность включения в комплементарную цепь флуоресцентно меченных дНМФ, несущих объемные группы флуоресцеин изотиоцианата, техасского красного или цианинового красителя Су5 модифицированной Taq ДНК-полимеразой (delta 280, F667Y), доступной из коммерческого источника под названием Taquenase, позволила авторам сделать вывод, что именно делеция 280 аминокислот этого фермента обеспечивает это свойство [Voss et al., 1997]. Подобного недостатка в виде неэффективного включения модифицированных дНМФ лишено, впрочем, флуоресцентное секвенирование с помощью меченных по 5'-концу праймеров.

О секвенировании ДНК при помощи праймеров, содержащих флуоресцентную метку на 5'-конце, сообщается во многих работах [Smith et al., 1985,1986; Ansorge et al., 1987; Kaiser et al., 1989]. Этот способ применяется достаточно широко, но одним из сдерживающих моментов является значительная стоимость синтеза подобных праймеров. Так, учитывая необходимость большого числа праймеров при секвенировании ДНК праймерной "прогулкой" и высокую стоимость олигонуклеотидов, содержащих молекулу флуоресцентного красителя, недавно было предложено осуществлять мечение секвенирующих праймеров путем их лигирования со специально синтезированным олигонуклеотидом, несущим подходящий флуорофор [Jang, Steffens, 1997]. Следует отметить, что для этого требовался еще один (третий) олигонуклеотид, содержащий на своем 5'-конце от 1 до 5 вырожденных нуклеотидов и выполняющий роль своеобразного мостика.

Заметное влияние не чувствительность и производительность автоматического секвенирования ДНК оказало создание в 1995 г. специальных несущих флуоресцеин и родамин олигонуклеотидных ЕТ-праймеров (Energy Transfer) с переносом энергии с одного флуорофора на другой [Ju et al., 1995b, 1996b). Следует заметить, что ранее в одной работе был синтезирован универсальный секвенирующий (М13) праймер, содержащий две молекулы флуоресцеинизотиоцианата, у пятого и двенадцатого нуклеотидов, представляющих собой производные урацила и использованных вместо остатков тимидина [Brumbaugh et al., 1988]. Для ЕТ-праймеров принято сокращенно обозначение типа D-N-A, где D означает молекулу донора, А - акцептора, а N - показывает расстояние между ними в нуклеотидах. Так, например, праймер с 6-карбоксифлуоресцеином (F) на своем 5'-конце в качестве донора и 6-карбокси-4',5'-дихлоро-2',7'-диметоксифлуоресцеином (J) модифицированного тимидина в 10-м положении олигонуклеотидной цепочки как акцептор обозначается F10J [Hung et al., 1996b].

Использование ЕТ-праймеров с флуоресцеином и родамином показало 2-14-кратное усиление флуоресценции по сравнению с праймерами, содержащими единичные флуоресцентные группы [Ju et al., 1995а, b]. Проведенный синтез 20 вариантов стандартного универсального М13(-40) праймера с расположенной на его 5'-конце молекулой карбоксифлуоресцеина (FAM или, иначе, просто F), выступающего в качестве донора, и "пришитыми" к по-разному удаленным нуклеотидам этого же (FAM) и другого производного флуоресцеина (JOE или J), и производных родамина (TMR или Т и ROX или R) в качестве акцепторных красителей позволил выявить наиболее эффективное их расположение. Так, оказалось, что максимальное увеличение флуоресценции наблюдается в тех случаях, когда акцепторные молекулы применяемых в данном случае флуорофоров располагались через 10 нуклеотидов от донорного красителя, находящегося на 5'-конце олигонуклеотидного праймера. Этими авторами также опробовались несколько иные варианты расположения донорных и акцепторных красителей. Так, вместо F10T и F10R были использованы варианты F3T и F3R соответственно, также приводившие к высокому качеству секвенирования ДНК. В дальнейшем проведенный детальный анализ показал, что максимальное увеличение флуоресценции ЕТ-праймеров проявляется, когда акцепторный краситель отстоит на 7-9 или 10-12 нуклеотидов для разных пар флуорофоров [Glazer, Mathies, 1997]. Целая серия работ этих авторов была посвящена созданию все новых ЕТ-праймеров с различными красителями, которые бы показывали улучшенные спектральные характеристики и незначительные отличия в своем влиянии на электрофоретическую подвижность меченных ими секвенируемых фрагментов ДНК [Hung et al., 1996a, b, 1997,1998]. Так, использование в качестве донорного флуорофора красителя цианинового ряда, возбуждаемого в широкой области спектра и имеющего несколько меньший квантовый выход, привело к сглаженным различиям в интенсивности сигнала разных акцепторных красителей, что позволило определять до 500 первых нуклеотидов со 100%-ной точностью в 4-цветном секвенировании ДНК [Hung et al., 1996a]. Было проведено исследование спектральных характеристик 56 синтезированных ЕТ-праймеров, отличающихся как донорными и акцепторными группами, так и природой спейсера между ними, который в одних случаях представлял собой цепочку нуклеотидов, а в других был представлен полидезоксирибозофосфатом [Hung et al., 1997]. Авторы остановились на двух наиболее оптимальных наборах, в которых донорами служили красители цианинового ряда, а акцепторами производные родамина.

Таким образом, применение праймеров с усиленной флуоресценцией за счет передачи энергии от одного красителя к другому позволило заметно увеличить чувствительность метода секвенирования ДНК. В случаях ограниченного количества исходной ДНК становилось неизбежным циклическое секвенирование и при этом оказалось достаточно 6 циклов, а для секвенирования всего 10 нг матрицы потребовалось только 15 циклов [Ju et al., 1995a]. Сообщается и об успешном секвенировании вместо обычных 2 мкг всего 0,25 мкг матрицы, для чего с обычными праймерами потребовалось бы уже циклическое секвенирование [Juetal., 1995b].

С целью снижения затрат на синтез большого числа требуемых ЕТ-праймеров с различающимися последовательностями нуклеотидов, было предложено их мечение с помощью специальной универсальной кассеты, включаемой обычным синтезом на 5'-конец олигонуклеотида [Ju et al., 1996a]. В этой кассете донорный и акцепторный флуорофоры разделены между собой полимерным спейсером, состоящим из остатков 1',2'-дезоксирибозофосфата. Секвенирование ДНК с такими праймерами показало увеличение сигнала от 2 до 12 раз и позволило "прочитать" с 99%-ной точностью 550 нуклеотидов.

BODIPY-красители оказались также пригодны для создания праймеров с переносом энергии, образуемой под воздействием соответствующего лазера [Metzker et al., 1996]. При использовании в качестве донора отдельных BODIPY-красителей акцепторные молекулы других BODIPY-красителей "пришивались"или к 3-му, или к 6-му нуклеотидам праймера, тогда как дополнительная метильная группа в этих случаях располагалась у 6-го или 3-го нуклеотида соответственно, что в итоге приводило к 180%-му и 360%-му усилению сигнала в том или другом варианте [Metzker et al., 1996]. Также сообщается о синтезе новых флуоресцентных красителей, являющихся производными флуоресцеина и родамина и способных быть донорами и акцепторами в переносе энергии и создании на их основе 4 наборов меченых праймеров для автоматического секвенирования ДНК [Lee et al., 1997].

Автоматическое секвенирование ДНК с помощью флуоресцентно меченных ддНТФ, вызывающих терминирование растущей цепи, было предложено достаточно давно [Prober et al., 1987] и благодаря целому ряду преимуществ данный подход используется весьма активно. Так, во-первых, в этом случае секвенирование ДНК могло осуществляться с использованием в качестве затравки обычных олигонуклеотидных праймеров, не несущих какой-либо другой метки. Во-вторых, имеющее иногда место ложное терминирование цепи ДНК становилось невидимым (поскольку такой фрагмент ДНК не содержал на своем 3'-конце флуоресцентно меченный ддНМФ) и это не вносило ошибки при регистрации нуклеотидной последовательности секвенируемой ДНК. (Попутно необходимо заметить, что прошло около 10 лет, прежде чем ддНТФ, меченные радиоактивным изотопом 33Р, стали использоваться для ручного секвенирования ДНК, о чем уже говорилось в разделе 2.5). Однако из-за неэффективного включения ддНМФ, например Taq ДНК-полимеразой, в заключительном растворе остается довольно значительное количество таких флуоресцентно меченных ддНТФ, которые интерферируют с разделением специфически терминированных продуктов секвенирующих реакций и ухудшают тем самым разрешающую способность метода. В этой связи желательно провести их удаление, и самым простым способом, хотя и не очень эффективным, является осаждение продуктов терминирующих реакций этанолом. Также был предложен подход к удалению невключившихся ддНТФ с помощью легкого центрифугирования реакционных смесей через сефадекс G-75 в специально подготовленном 96-ячеечном планшете микротитратора [Krakowski et al., 1995]. В другой работе для этой цели был изготовлен специальный блок из органического стекла, вмещавший 24 колонки [Rosenthal, Charnock-Jones, 1992]. При использовании для секвенирования биотинилированных праймеров задача удаления флуоресцентно меченных ддНТФ может быть решена с помощью магнитных частиц М-280 Streptavidin, покрытых стрептавидином, очень просто и быстро, поскольку фирма "DYNAL", являющаяся изготовителем данных частиц, сообщает, что на проведение этой процедуры требуется менее 10 мин [Anonymous, 1998].

Особенностью меченых ддГТФ, ддАТФ, ддЦТФ и ддТТФ, предложенных Пробером и соавт. [Prober et al., 1987; Prober, 1994], было то, что они несли незначительно отличающиеся производные сукцинилфлуоресцеина (SF-505, SF-512, SF-519, SF-526, где цифрами обозначены максимумы эмиссии в нанометрах) с разными спектрами эмиссии, что позволяло детектировать их в одной дорожке секвенирующего геля. Определенным преимуществом данных флуоресцентных соединений было то, что, имея близкие молекулярные массы, они не вызывали серьезных различий в электрофоретической подвижности меченных ими цепей ДНК и, таким образом, не требовалось специальных компьютерных программ для внесения соответствующих поправок, как в случае с некоторыми другими соединениями. Так, использование в автоматическом секвенировании ДНК в качестве флуоресцентных молекул флуоресцеина, тетраметилродамина, NBD (4-хлоро-7-нитробензо-2-окса-1-диазол) и техасского красного, заметно отличающихся своими размерами, уже требовало определенной коррекции электрофоретической подвижности фрагментов, терминированных различными типами оснований. Другими авторами было проведено детальное сравнение эффективности секвенирования ДНК с помощью указанных выше терминаторов, а также целого ряда синтезированных ими измененных производных этих и некоторых других красителей [Lee et al., 1992]. Приведенные в этой работе результаты показали, что синтезированный набор ддНТФ, меченных различными флуоресцентными красителями (5FAM, 6FAM, DCF-1, DCF-2, EVE, R110-2, BUB1, BUB2, 5ZOE, LOU1, LOU2, NAN2 и др.), приводит к формированию более равномерных пиков флуоресценции при разделении продуктов терминирующих реакций в автоматическом секвенаторе.

Сообщается о синтезе новых, с улучшенными свойствами флуоресцентных терминаторов синтеза цепи ДНК [Rosenblum et al., 1997]. Так, в данной работе было проведено сравнение ддНТФ, несущих производные родамина, с ддНТФ, меченными производными дихлорородамина, а также BigDye-терминаторов, представляющих собой комплекс красителей, рассчитанный на передачу энергии от одного красителя к другому. Из 18 синтезированных вариантов BigDye-терминаторов, отличающихся донорными и акцепторными красителями, а также типом линкера, были отобраны наиболее оптимальные варианты, применяемые в дальнейшем исследовании. Так, донорным красителем служило производное флуоресцеина и акцепторным красителем был 5-карбоксиди-хлорородамин. Проведенный анализ результатов секвенирования ДНК с использованием ддНТФ, меченных стандартными производными родамина, дихлорородамина и BigDye-терминаторов показал, что последние характеризовались и более сильным сигналом и повышенной точностью секвенирования. Усредненные показатели для разных матриц ДНК, отличающихся GC-составом, свидетельствуют, что количество "читаемых" с 98%-ной точностью нуклеотидов составляет для ддНТФ с родамином 663 нуклеотида, для ддНТФ, меченных дихлорородамином, - 748 нуклеотидов, и для BigDye-терминаторов - 759 нуклеотидов, но при этом интенсивность флуоресценции у дихлорородамина была значительно ниже, чем у остальных, а максимальной характеризовались, как и следовало ожидать, BigDye-терминаторы. К сходному выводу о предпочтительности использования dRhodamine- и BigDye-терминаторов вместо обычно применявшихся ранее уже привычных терминаторов, несущих различные флуоресцентные группы, пришли и другие авторы [Zakeri et al., 1998]. Преимущества используемых в этих работах терминаторов заключаются в лучшей равномерности пиков и повышенной чувствительности. Сообщается об успешном применении BigDye-терминаторов в широкомасштабном секвенировании геномов микроорганизмов, позволивших "читать" свыше 700 нуклеотидов, что способствовало заполнению имевшихся промежутков на завершающем этапе выполнения этого проекта [Heiner et al., 1998].

Упоминавшиеся выше красители имеют одно общее для всех свойство, а именно, испускание флуоресценции в видимой части спектра. Красители цианинового ряда, флуоресцирующие в области спектра, близкой к инфракрасной, также используются в автоматическом секвенировании ДНК [Shealy et al., 1995; Williams, Soper, 1995; Flanagan et al., 1998; Tu et al., 1998]. К некоторому преимуществу этих красителей можно отнести то, что в этой области спектра отсутствует какая-либо интерференция с биологическими молекулами, что снижает, таким образом, уровень шумов.