Матрицы для автоматического секвенирования днк

Определение "Матрицы для автоматического секвенирования днк" в ЭБНБ

Важной составляющей процесса секвенирования ДНК являются одно- или двуцепочечные матрицы. От их количества (как, впрочем, и от качества), во многом зависит производительность всего метода. При крупномасштабном секвенировании ДНК требуется настолько большое число матриц, что их подготовка стандартными способами, без применения автоматизации, становится лимитирующим фактором всего процесса.

При автоматическом секвенировании ДНК в качестве матриц наиболее часто применяются одно- или двуцепочечные молекулы фагов, плазмид или фагмид (кроме ПЦР-продуктов, которые представляют собой отдельный тип матриц для секвенирования). Выделение требуемого большого количества подобных образцов представляет собой некоторую проблему. Так, в работе Эперона сообщалось об изготовлении специальной установки, рассчитанной на одновременное выделение 96 таких образцов с помощью фильтрации [Eperon, 1986]. Выделенные таким образом одноцепочечные препараты ДНК на основе фага М13 показали высокое качество секвенирования, сравнимое с матрицами, получаемыми обычным путем с использованием того же полиэтиленгликоля в качестве осадите ля фаговых частиц. Впоследствии этот метод был слегка модифицирован [Eperon et al., 1988]. Предложенные в этих работах процедуры в дальнейшем подверглись некоторому усовершенствованию путем применения специального лабораторного робота Biomek 1000 (Beckman, США), что позволило выделять до 192 образцов ДНК в день [Smith et al., 1990]. В другой своей работе эти авторы сообщают об успешном выделении 384 образцов фагмидной одноцепочечной ДНК в день ручным способом, который, впрочем, мог быть легко автоматизирован [Rawlinson et al., 1991]. Однако осаждение фаговых частиц с помощью полиэтиленгликоля не совсем удобно, с точки зрения автоматизации этого процесса, из-за довольно высокой вязкости самого раствора, поэтому было предложено осаждать фаг уксусной кислотой [Zimmermann et al., 1989]. В этой работе все процедуры по осаждению фаговых частиц, очистке фаговой ДНК с помощью ее связывания со специальным стеклянным фильтром и последующими отмывками 4М перхлоратом натрия, 70%-ным этанолом и заключительная элюция 0,1 х ТЕ проводились с использованием лабораторного робота Biomek 1000, что позволило авторам исключить необходимые прежде этапы центрифугирования и автоматизировать весь этот процесс выделения и очистки матриц ДНК полностью. Об очистке плазмидных матриц, пригодных для автоматического секвенирования ДНК с помощью 96-луночных микротитраторных планшетов со стеклофильтром, и сообщается в другой работе [Itoh et al., 1997]. В литературе также приводятся сведения об использовании различных вариантов крупномасштабного выделения одно- и двуцепочечных ДНК матриц для секвенирования, незначительно отличающихся выбором способов осаждения и очистки молекул ДНК [Mardis, Roe, 1989; Kolner et al., 1994; Zollo, Chen, 1994; Andersson et al., 1996; Beg, Holt, 1998]. Впрочем, в отдельных работах встречаются упоминания, что для автоматического секвенирования даже не потребовалось какой-то особой очистки ДНК матриц [Wilson et al., 1990; Trower et al., 1995; Chen et al., 1996]. Так, авторы последней работы сообщают, что они лишь обрабатывали бактериальный осадок протеиназой К, затем нагревали до 95° С, центрифугировали и отобранный супернатант уже непосредственно использовали для проведения циклического флуоресцентного секвенирования.

Некоторая экономия в приготовлении матриц на основе фага М13 для автоматического флуоресцентного секвенирования, предложенная японскими авторами [Mita et al., 1994], заключалась в одновременном секвенировании таких одноцепочечных матриц как с помощью прямых, так и обратных праймеров после построения комплементарной цепи, как это было ранее предложено для обычного секвенирования ДНК [Hong, 1981].

Продукты ПЦР, доступные в большом количестве, благодаря различным ДНК амплификаторам, представляют собой другой тип матриц для автоматического секвенирования [Rosenthal et al., 1993]. Если очистка таких ПЦР-продуктов для дальнейшего секвенирования ручным способом могла также проводиться вручную, обеспечивая подготовку требуемого количества матриц, то для автоматического секвенирования с резко возросшим потоком образцов ДНК без применения лабораторных биороботов было уже не справиться. В связи с этим практически непременным условием автоматизации этого процесса является использование биотинилированного праймера и магнитных частиц со стрептавидином, позволяющих осуществить отделение целевого продукта ПЦР от ставших ненужными ингредиентов этой реакции. Так, в литературе описаны различные модификации лабораторных роботов, позволяющих проводить необходимое пипетирование и разделение фаз с помощью магнита [Alderton et al., 1992; Fry et al., 1992; Wahlberg et al., 1992; Tong, Smith, 1993; Rolfs, Weber, 1994]. Разработанная для этой цели фирмой "DYNAL" (Норвегия) магнитная установка MPC-auto96 позволяет подключать ее к биороботу Biomek и осуществлять необходимые процедуры по выделению и очистке матриц ДНК [Deggerdal et al., 1998].