Векторы на основе фага m13

Определение "Векторы на основе фага m13" в ЭБНБ

Желание изложить развитие методов молекулярного клонирования небольших фрагментов ДНК и связанного с ним секвенирования ДНК, насколько это возможно, в хронологическом порядке, заставляет на время отвлечься от плазмидных векторов и рассмотреть небольшие одноцепочечные фаговые вектора, тем более, что они оказали, как будет видно из дальнейшего изложения, серьезное влияние на процесс создания последующих поколений векторов.

Небольшие одноцепочечные нитевидные фаги типа Ff, к которым относятся бактериофаги fl, fd, M13 и некоторые другие, были известны достаточно давно и их биология хорошо изучена. Весьма важным свойством этих фагов явилось то, что они не вызывали лизиса бактерий, а только задерживали их рост, в результате чего на бактериальном газоне формировались светлые зоны фаговых бляшек. Также было известно, что при упаковке мутантных фагов в отличие от одно-цепочечного изометрического фага фХ174 образовывались фаговые частицы большего размера, которые могли инфицировать клетки E.coli.

Мессингом и соавт. при первой попытке использовать дикий фаг М13 в качестве вектора для молекулярного клонирования был проведен элегантный эксперимент, направленный на выявление области фага M13, в которую можно было внедрять фрагменты чужеродной ДНК без ущерба для жизнедеятельности фага [Messing et al., 1977]. В качестве маркерной молекулы был выбран HindII-фрагмент β-галактозидазы, который, как было известно, в условиях α-комплементации с аналогичным геном LacZΔM15, несущим мутацию и расположенным на хромосоме E.coli, мог формировать функциональный фермент и при добавлении соответствующего хромогенного субстрата и индуктора давать голубое окрашивание. Было осуществлено недорасщепление фага М13 рестрикционной эндонуклеазой BsuI, имеющей в этом векторе 10 сайтов узнавания, и с помощью гель-электрофореза отобраны линейные формы с единичными разрывами цепи. В результате клонирования HindII-фрагмента β-галактозидазы был отобран фаг, стабильно наследующий данный признак, обозначенный как M13mpl. Местом клонирования вставки оказалась межгенная область между II и IV генами фага. Следующим этапом совершенствования данного вектора для молекулярного клонирования было добавление во фрагмент гена β-галактозидазы, обозначаемого как LacZ', уникального сайта рестрикционной эндонуклеазы EcoRI, осуществленное с помощью химического мутагенеза, в результате чего образовались вектора М13тр2 и М13трЗ [Gronenborn, Messing, 1978]. Дальнейшие улучшения векторов на основе одноцепочечного фага М13 привели к последовательному добавлению уникальных сайтов узнавания для рестрикционных эндонуклеаз HindIII и ВатHI. Однако это был еще не настоящий полилинкер, а, скорее, его прообраз. Настоящая революция в создании векторов произошла после помещения в маркерный β-галактозидазный ген химически синтезированного участка ДНК, содержащего расположенные друг за другом уникальные сайты узнавания для целого ряда гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз, пригодные для их использования в клонировании.

Первые сконструированные полилинкеры представляли собой симметричные последовательности, несущие по два сайта узнавания некоторых рестрикционных эндонуклеаз, как, например, EcoRI-ВатHI-SalI-PstI-SalI-BamHI-EcoRI. Создание впоследствии асимметричных полилинкеров, таких как, например, EcoRI-SmaI-BamHI-SalI-PstI--HindIII в векторе М13mp9 или ему подобных, привело к возможности использования для выделения вставки одновременно двух разных ферментов, узнающих отличающиеся последовательности и образующих как 5', так и 3'-выступающие концы, что было необходимо или для мечения только одного из них, или переклонирования в другом векторе в заранее заданной ориентации. Последовательности полилинкеров были сконструированы таким образом, что не нарушали рамку считывания NH₂-терминального фрагмента β-галактозидазы, но при клонировании какого-либо фрагмента ДНК функциональная целостность фермента нарушалась и при использовании специального хромогенного субстрата 5-бромо-4-хлоро-галактозида (x-gal) и индуктора изопропил-(3-тиогалактозида (ИПТГ) легко выявлялись рекомбинантные бактериофаги, несущие вставки. Отдельные случаи сохранения голубого окрашивания рекомбинантными фаговыми бляшками, равно как плазмидами и фагмидами, происходят вследствие клонирования небольших вставок с количеством нуклеотидов кратным 3, что не приводит к нарушению рамки считывания гена β -галактозидазы (конечно, при условии отсутствия терминирующих кодонов во вставке).

В течение ряда лет была сконструирована целая серия одноцепочечных векторов М13тр, отличающихся только своими полилинкерами (М13тр6, М13тр7, М13тр8, М13тр9,..., М13тр18, М13тр19) [Messing et al., 1981; Messing, Vieira, 1982; Vieira, Messing, 1982; Messing, 1983; Norrander et al., 1983; Yanisch-Perron et al., 1985]. Позднее на основе некоторых из них были созданы вектора mICE с фаговыми промоторами Т7 и SP6, обладающие рядом преимуществ [Ерегоп, 1986]. Следует отметить, что до недавнего времени продолжались работы по улучшению векторов данного семейства и им подобных [Benes et al., 1993]. Все это было вызвано тем, что одноцепочечные вектора на основе фага М13 оказались крайне удобными при выполнении проектов по секвенированию фрагментов ДНК ферментативным методом Сэнгера. Небольшое семейство векторов mWB (mWB2341, mWB2342, mWB2344) [Barnes, Bevan, 1983; Barnes et al., 1987], сконструированное на основе того же одноцепочечного фага М13, несло ряд черт, делающих их несколько отличными от векторов семейства М13тр. Так, полилинкер у этих векторов располагался в ином месте фага и за счет этого (возможно?) клонированные вставки в нем были более стабильны. Это позволило клонировать в нем крупные фрагменты ДНК длиною до 12 и даже 14 тпн. Ориджин репликации в этих векторах был расположен так, что фаг нарабатывал (-)-цепь ДНК. Еще одной особенностью было то, что все фаговые бляшки, как принадлежащие исходному вектору, так и содержащие вставки, несли голубое окрашивание и только специально осуществляемые делеции вставок, приводящие в ряде случаев к их полному удалению и затрагивающие при этом область Lac-оператора, расположенную уже за вставкой, приводили к исчезновению голубого окрашивания. Следует отметить, что данные векторы были специально созданы для стратегии килосеквенирования ДНК, осуществляемой путем получения однонаправленных делеций вставки.

Таким образом, одноцепочечные векторы на основе нитевидного фага М13 являются самостоятельным типом векторов, но за счет существования в жизненном цикле фага двуцепочечной репликативной формы, позволяющей работать с ней как с плазмидой, они дали "строительный материал" для создания следующих поколений плазмидных векторов.