Плазмидные векторы, шестое поколение

Определение "Плазмидные векторы, шестое поколение" в ЭБНБ

Фагмидный вектор pSequoiaT12

Первые два поколения плазмидных векторов, предназначенные для клонирования фрагментов ДНК, имели естественное расположение сайтов узнавания как гексануклеотидных, так и тетрануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз. Все последующие поколения векторов общего назначения имели, кроме прочих преимуществ, также искусственно созданный полилинкер, в котором были сосредоточены сайты узнавания нескольких гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз. Для того чтобы появилась возможность расщеплять вектор для целей клонирования и субклонирования по сайту узнавания какой-либо полилинкерной рестрикционной эндонуклеазы, в остальной части вектора такой же сайт (если он имелся) было необходимо удалить. Так, векторы третьего поколения (pUC и им подобные) имели в отличие от своих предшественников уже не естественное расположение сайтов узнавания некоторых ключевых (полилинкерных) гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз в самой последовательности вектора. Однако все плазмидные, фаговые, фагмидные (а также и космидные) векторы предыдущих поколений все же имели весьма существенный недостаток в виде наличия в векторной последовательности сайтов узнавания для частощепящих рестрикционных эндонуклеаз с тетрануклеотидными участками узнавания, ввиду чего было невозможно расщеплять вставку этими ферментами, поскольку это неминуемо привело бы к разрушению вектора. Поэтому уникальной чертой векторов pSequoia можно считать отсутствие в их нуклеотидной последовательности сайтов узнавания для нескольких частощепящих рестрикционных эндонуклеаз с тетрануклеотидными участками узнавания. Это весьма важное и сулящее значительные удобства и преимущества новшество делает семейство фагмидных векторов pSequoia весьма удобными не только для секвенирования протяженных фрагментов ДНК, но и при проведении различных молекулярно-биологических экспериментов, требуется работа с частью вставки, как, например, при футпринтинге или исследовании белково-нуклеиновых взаимодействий с помощью метода торможения в геле.

Проведенный анализ наиболее известных фагмидных векторов показал наличие множественных сайтов для большинства тетрануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз в их последовательности. Так, в векторе pGEM-5Zf имеется 20 сайтов узнавания для рестрикционной эндонуклеазы HhaI (CGCG), по 18 для AluI (ACGT) и Tru9I (TTAA), 14 для Sau3AI (GATC) и по 5 для RmaI (CTAG) и TaqI (TCGA). В то же время в данном векторе имеется всего один сайт тетрануклеотидной рестрикционной эндонуклеазы RsaI, расположенный в гене β-лактамазы. Для создания вектора с отсутствием в нем сайтов расщепления для тетрануклеотидной рестрикционной эндонуклеазы RsaI был проведен сайтна-правленный мутагенез с целью замены одного нуклеотида в единственном сайте узнавания тетрануклеотидной рестрикционной эндонуклеазы RsaI (GTAC) и в совпадающем с ним же сайте гексануклеотидной рестрикционной эндонуклеазы SeaI (CGTACG) в гене β-лактамазы, определяющем устойчивость к антибиотику ампициллину, таким образом, что за счет вырожденности генетического кода замены аминокислоты Glu не произошло, но оба эти сайта перестали узнаваться данными ферментами [Чемерис и др., 1996]. В результате такого мутагенеза появилась возможность расщеплять клонированный фрагмент ДНК без опасения расщепить сам вектор с помощью тетрануклеотидной рестрикционной эндонуклеазы RsaI или ее неоизошизомера Csp6I, генерирующего в отличие от RsaI 5'-выступающий липкий конец 5'-ТА, пригодный для клонирования в некоторые концы, генерируемые гексануклеотидными эндонуклеазами рестрикции и, в частности, в сайт узнавания фермента NdeI, имеющийся в полилинкере векторов pSequoia. Созданный таким образом вектор получил наименование pSequoiaT12, стал первым из создаваемого семейства фагмидных векторов pSequoia и открыл новое поколение векторов общего назначения (рис.).

Другой уникальной чертой вектора pSequoiaT12 является наличие в его полилинкере сайтов узнавания для октануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз SwaI или ее изошизомера SmiI (ATTTAAAT) и SrfI (GCCCGGGC). Справедливости ради следует отметить, что в полилинкерах некоторых векторов сайты некоторых октануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз имелись и раньше. Так, например, в полилинкерах фагмид семейства pBluescript и pGEMZf имеется сайт для рестрикционной эндонуклеазы NotI. Одной из причин отсутствия подобных сайтов для октануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз в полилинкерах различных векторов является то, что при конструировании большинства полилинкеров (сохранившихся без изменения до сего дня) был известен только один такой фермент NotI, узнающий непрерванную палиндромную октануклеотидную последовательность GCGGCCGC. Однако относительно недавно было обнаружено несколько подобных ферментов, что дало возможность сконструировать новый полилинкер с сайтами узнавания для этих рестрикционных эндонуклеаз. В то же время нельзя не отметить практически полное отсутствие в полилинкерах векторов пятого и предшествующих поколений полиндромных октануклеотидных сайтов узнавания для еще не обнаруженных ферментов, но при этом потенциально существующих. Так, в уже упомянутых фагмидных векторах семейства pBluescript, несмотря на их довольно протяженный полилинкер, имеется всего четыре подобных сайта, включая NotI-сайт. Вектор pJRD184 [Heusterspreute et al., 1985] имеет в своей последовательности 43 уникальных сайта рестрикционных эндонуклеаз, но из них в полилинкере локализовано всего 14 и в них только 2 палиндромных октануклеотидных участка для потенциальных рестрикционных эндонуклеаз. Что касается суперполилинкера SL2 вектора pSL301, содеражащего все 64 возможных варианта для гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз, узнающих не прерванные палиндромные последовательности, причем как уже обнаруженных в природе, так и для еще не выявленных [Brosius, 1989], то среди них имеется лишь 9 октануклеотидных палиндромных участка, включая единственный для уже обнаруженного фермента NotI. 7 октануклеотидных палиндромных участка содержит в своем полилинкере вектор pNEB193, поставляемый фирмой "New England Biolabs, Inc". (США), из которых 4 доступны для расщепления уже известными ферментами (AscI, PacI, PmeI и Sse8387I). Вектор pSequoiaT12, кроме уже упомянутых выше сайтов для октануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз SwaI (ATTTAAAT) и SrfI (GCCCGGGC), несет еще один подобный сайт для фермента Sse8387I (CCTGCAGG), а также еще пять участков для потенциальных октануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз (CGAATTCG, CGAGCTCG, CGTTAACG, CGATATCG, CAAGCTTG). В приведенных участках выделены сайты узнавания гексануклеотидных ферментов: EcoRI, SacI, HpaI, EcoRV, HindIII соответственно. Конечно, 8 сайтов из потенциальных 256 составляют ничтожную долю, но при составлении новых полилинкеров, видимо, надо принимать в расчет и возможность обнаружения какой-либо октануклеотидной рестрикционной эндонуклеазы. В то же время полилинкер с большим числом сайтов узнавания для потенциальных октануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз неприемлем, хотя бы из-за своей длины.

Преимущества, приобретаемые вектором pSequoiaT12 от удаления в его последовательности сайтов узнавания рестрикционной эндонуклеазы RsaI и наличия в полилинкере сайтов узнавания редкощепящих октануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз SwaI (или ее изошизомера SmiI) и SrfI детально рассмотрены в разделе, посвященном стратегиям секвенирования протяженных фрагментов ДНК.