Плазмидные векторы, пятое поколение

Определение "Плазмидные векторы, пятое поколение" в ЭБНБ

Как уже отмечалось выше, одноцепочечные векторы серии М13mp оказали значительное влияние на развитие и совершенствование плазмидных векторов третьего и последующих поколений. Векторы же пятого поколения представляют собой гибридные конструкции, содержащие, кроме плазмидных последовательностей, межгенный участок одноцепочечного нитевидного фага f1 (родственный фагу М13), ответственный за репликацию фага. Такие химерные векторы, содержащие два участка инициации репликации П/Со1Е1, были названы фагмидами. Одной из первых фагмид была pD4, представляющая собой плазмиду pBR322 со вставкой участка фага f1 размером 1250 пн [Dotto et al., 1981]. Этот участок был просто клонирован в плазмиде pBR322 с целью изучения его функций и в качестве специализированного вектора эта конструкция не использовалась. Первыми специально сконструированными фагмидами были вектора семейства pEMBL, созданные на основе векторов pUC8/pUC9 и межгенного участка одноцепочечного фага f1 [Dente et al., 1984]. Данный участок фаговой ДНК, так называемый f1 ориджин репликации, помещенный в эти вектора в разных ориентациях, после суперинфекции специальным хелперным фагом М13К07 или R408 приводил к секреции (+)- или (-)-цепей ДНК, что потребовало соответствующего обозначения фагмид - pEMBL8+, pEMBL8-, pEMBL9+ и pEMBL9-. Если плазмидные векторы семейства pUC существовали в парных комбинациях, отличаясь ориентацией полилинкера, то многие существующие ныне фагмиды представляют собой набор из четырех возможных вариантов (две ориентации полилинкера, две ориентации f1 ориджина репликации, приводящие к секреции (+)- или (-)-цепей ДНК), что значительно расширяет возможности исследователей.

Другое решение проблемы секреции разных цепей ДНК было предложено в фагмидных векторах pKUN9 и pKUN19, являющихся производными от плазмид pUC9 и pUC19 [Peeters et al., 1986]. Уникальной чертой этих векторов явилось то, что кроме f1 ориджина репликации они несли расположенный в противоположной ориентации еще один подобный участок от одноцепочечного нитевидного фага 1Ке, родственного фагам группы Ff. Несмотря на аналогичную организацию генома этих одноцепочечных фагов, гомология их нуклеотидных последовательностей составляет всего лишь 55% и за счет этого не происходит перекрестного узнавания их сигнальных последовательностей. Таким образом, имеется возможность секреции одной цепи ДНК в ответ на суперинфекцию хелперными фагами М13К07, R408 и другой цепи после суперинфекции хелперными фагами IKe-9, Mike A [Konings et al., 1986]. Следует отметить, что несмотря на привлекательность данного подхода, он все же не получил широкого развития.

Химерные фагмидные векторы обладают целым рядом преимуществ, поскольку сочетают в себе все важные черты как одноцепочечных фаговых векторов, так и плазмидных векторов. Такое взаимодополнение векторов разных типов привело к ситуации, которую можно назвать "два в одном", и эти, как бы "самостоятельные", векторы в составе фагмиды приобрели для себя новые важные свойства и улучшения. Так, если рассмотреть, какие преимущества приобрел одноцепочечный фаговый вектор (собственно вектором и не являющийся, поскольку в фагмиде, во-первых, все же больше плазмидного и, во-вторых, требующим для формирования фаговых частиц специальный хелперный фаг в связи с отсутствием генов, кодирующих фаговые белки) в составе фагмиды, то можно видеть, что получение ДНК в одноцепочечной форме не приводит к нестабильности клонированных фрагментов ДНК большого размера по сравнению с аналогичными фрагментами, клонированными ранее в векторах серии М13тр. Главной причиной такой повышенной стабильности вставок (особенно содержащих повторяющиеся элементы) является репликация по типу плазмиды и то, что существование их в одноцепочечной форме в процессе жизнедеятельности фагмиды весьма кратковременно и даже необязательно. Второй особенностью, связанной с одноцепочечной формой, является возможность формировать фаговые частицы с (+)- или (-)-цепью ДНК в зависимости от ориентации f 1 ориджина репликации. (Собственно такая возможность теоретически существовала и для самих фаговых векторов, но практически она была не реализована ввиду того, что проблема разных цепей решалась для них наличием разнонаправленных полилинкеров.) Другим важным отличием фагмид от фаговых векторов является значительно больший размер последних. Обычный размер фагмидных векторов варьирует от 3 до 4 тпн, тогда как вектора серии М13mp имеют размер около 6,5 тпн. За счет такой разницы в размерах в фагмидах возможно клонирование фрагментов ДНК гораздо большего размера (до нескольких тпн) при высокой стабильности вставки, тогда как в одноцепочечных фаговых векторах вставки крупнее 1 тпн за счет делеций часто оказывались нестабильными. Хотя, как уже отмечалось выше одноцепочечные вектора серии mWB стабильно поддерживали вставки до 14 тпн [Barnes, Bevan, 1983]. Выделение двуцепочечной репликативной формы фагового вектора как для целей клонирования, так и для анализа размера вставок гель-электрофорезом и их рестриктазного картирования связано с некоторыми трудностями, тогда как ни крупномасштабное, ни мелкомасштабное выделения двуцепочечной ДНК в составе фагмиды не представляет каких-либо проблем.

Приобретенные от такого союза преимущества для "фагового вектора" в составе фагмиды значительно перевешивали некоторые недостатки количественного характера и введение дополнительного этапа, необходимого для запуска репликации по фаговому типу. Так, несмотря на несколько меньший выход одноцепочечной фагмидной ДНК по сравнению с настоящим фаговым вектором, количества ДНК, получаемого из 1 мл жидкой культуры, вполне хватало на проведение секвенирующих реакций. Дополнительным, впрочем весьма несложным, этапом была необходимость суперинфекции культуры E.coli, несущей фагмиду, специальным хелперным фагом, запускающим механизм репликации по фаговому типу и обеспечивающим упаковку одноцепочечной ДНК фагмиды фаговыми белками. Были разработаны упомянутые выше специальные хелперные фаги R408 и М13К07, IКе-9 и Mike Δ, секретирующиеся вместе с фаговыми частицами, содержащими одноцепочечную фагмидную ДНК, но не интерферирующие с ней на этапе отжига праймера и при проведении секвенирующих реакций. Более того, в литературе сообщается о легко воспроизводимом методе получения одноцепочечной ДНК фагмид после трансформации ими компетентных клеток E.coli, уже содержащих хелперный фаг, что исключает необходимость дополнительного этапа суперинфекции [Jupin, Gronenborn, 1995].

Что касается преимуществ, полученных самим плазмидным вектором от объединения с f1 ориджином репликации одноцепочечного фагового вектора, то оно всего одно, но очень значительное. Если описанные выше преимущества, полученные фаговым вектором от объединения, носят, главным образом, количественный характер, то плазмида получила качественно новое и очень важное свойство, а именно возможность существовать в одноцепочечной форме, которое ранее ей было недоступно.

За счет таких универсальных свойств фагмидные векторы общего назначения практически вытеснили для целей молекулярного клонирования обыкновенные плазмиды. Так, в каталогах некоторых ведущих молекулярно-биологических фирм почти не осталось обыкновенных плазмид общего назначения и вместо них предлагаются аналогичные фагмиды. Наибольшее распространение получили серия фагмидных векторов pGEM-Zf, поставляемых фирмой "Promega" и серия векторов pBluescript, поставляемых фирмой "Stratagene". Они характеризуются стандартными чертами фагмидных векторов и практически все отличия между ними заключены в полилинкерах. Так, например, группа векторов pBluescript представлена всеми четырьмя возможными вариантами (pBluescript II SK+/-, pBluescript II KS+/-, где буквами SK и KS обозначены разнонаправленные полилинкеры с граничными сайтами узнавания для рестрикционных эндонуклеаз SacI и KpnI соответственно) [Alting-Mees, Short, 1989]. Данные вектора имеют достаточно большие участки MCS, где, кроме упомянутых выше рестрикционных эндонуклеаз, имеются участки узнавания для следующих ферментов: SacII, NotI, XbaI, SpeI, ВатIII, SmaI, PstI, EcoRI, EcoRV, HindIII, ClaI, SalI, XhoI и ApaI, приведенные здесь в направлении от SacI к KpnI. Кроме этих векторов линейка фагмидных векторов фирмы "Stratagene" включает ряд сходных векторов рВС+/-, но несущих вместо гена устойчивости к ампициллину ген устойчивости к хлорамфениколу, фагмид pBS+/- с полилинкерами от pUC19 и некоторые другие. Фагмидные вектора семейства pGEM-Zf фирмы "Promega" (pGEM-3Zf, pGEM-5Zf, pGEM-7Zf, pGEM-9Zf, pGEM-1lZf, pGEM-13Zf) существуют в попарных (+/-) комбинациях и отличаются своими полилинкерами, где первый вектор этого семейства pGEM-3Zf(+/-) несет полилинкер от плазмиды pUC19. Однако следует отметить то, что практически все отличия существующих фагмидных векторов друг от друга заключаются в различно организованных полилинкерах и в генах устойчивости к разным антибиотикам.