Плазмидные векторы, третье поколение

Определение "Плазмидные векторы, третье поколение" в ЭБНБ

Третье поколение плазмидных векторов представляет собой сильно модифицированные вектора семейства pBR. Его наиболее известными представителями являются вектора семейства pUC, разработанные Мессингом и соавт. [Viera, Messing, 1982]. От pBR322 им в наследство достался репликон ColEl, маркерный ген устойчивости к ампициллину, еще меньший размер (главным образом, за счет удаления гена устойчивости к тетрациклину). Данные векторы характеризовались весьма высокой копийностью, достигающей 200 копий на клетку. Однако главными новыми чертами этих плазмидных векторов можно считать маркерный ген, кодирующий NH₂-концевой фрагмент β-галактозидазы LacZ' и встроенный в него полилинкер от одноцепочечных векторов серии М13mp. Дальнейшее расширение семейства векторов pUC шло за счет увеличения количества сайтов узнавания в полилинкере, называемом также MCS [Multiple Cloning Sites)]. Так, данные векторы, сконструированные попарно (pUC8/pUC9,..., pUC18/pUC19), несли в парах одинаковые MCS, но ориентированные в противоположных направлениях аналогично своим "двоюродным братьям" - векторам серии М13mp. Такая двунаправленная последовательность расположения сайтов узнавания рестрикционных эндонуклеаз в полилинкере давала определенные преимущества в отдельных случаях молекулярного клонирования. Общей чертой всех этих MCS векторов серии pUC являлось то, что они по краям были ограничены сайтами узнавания рестрикционных эндонуклеаз EcoRI и HindIII, тогда как внутренние участки у них несколько отличались. Однако, несмотря на довольно большой выбор сайтов для клонирования рестриктазных фрагментов ДНК, полилинкеры этих векторов pUC семейства все же не в полной мере удовлетворяли запросам экспериментаторов и в связи с этим шло активное конструирование подобных плазмидных векторов, характеризующихся главными чертами векторов серии pUC (ген устойчивости к ампициллину, ColE1 репликон и маркерный ген, кодирующий Ш2-концевой фрагмент β-галактозидазы LacZ' со встроенным в него участком MCS), но с полилинкером, несущим или другую последовательность сайтов узнавания тех же рестрикционных эндонуклеаз в нем или с добавлением ранее не использовавшихся. Весьма интересно семейство векторов pMTL, характеризующееся некоторыми отличающимися чертами от pUC векторов и имеющее полилинкер, во-первых, с другим более удобным расположением сайтов узнавания для наиболее часто используемых ферментов и, во-вторых, с добавлением значительного количества новых, что сделало данные векторы более приспособленными для клонирования и последующего секвенирования фрагментов ДНК, полученных в результате ультразвуковой обработки [Chambers et al., 1988]. Следует отметить, что такой элемент практически любого современного плазмидного вектора, как полилинкер или участок MCS, подвергся за эти годы наибольшей модификации, выражающейся в постоянно продолжающемся конструировании данных участков со всевозможными вариантами сайтов узнавания для рестрикционных эндонуклеаз. Так, созданы участки MCS, называемые суперполилинкерами и, действительно, таковыми являющиеся, поскольку самый протяженный из них SL2 векторов pSL300 и pSL301 имеет длину 353 пн и содержит все 64 возможных варианта для гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз, узнающих непрерванные палиндромные последовательности, причем как для уже обнаруженных в природе, так и для еще не выявленных [Brosius, 1989].

Однако, для того чтобы все существующие в MCS сайты узнавания гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз были пригодны для использования их в качестве сайтов для молекулярного клонирования, необходимо, чтобы они были уникальными, т.е. не встречались больше в остальной последовательности вектора. Кроме действительно изначально уникальных, для некоторых ферментов имелись дополнительные участки узнавания в других местах векторной молекулы. Первые векторы, как семейства одноцепочечных фаговых векторов М13mp, так и семейства pUC, подвергали химическому мутагенезу с целью изменения отдельных нуклеотидов в нежелательных сайтах узнавания тех или иных рестрикционных эндонуклеаз и в результате кропотливого анализа отбирали требуемые варианты. В последующем, с появлением и разработкой метода сайт направленного мутагенеза, осуществляемого с помощью специально синтезированного олигонуклеотидного праймера, несущего измененный неспариваемый нуклеотид, процедура удаления ненужных сайтов узнавания рестрикционных эндонуклеаз существенно упростилась.

Таким образом, третье поколение плазмидных векторов несет в себе кардинально новые черты, не присущие векторам предыдущих поколений, которые не могут случайно возникнуть в природе, и объединенные в одном векторе экспериментаторами. Считаем важным подчеркнуть, что для создания векторов третьего поколения потребовалось удаление сайтов узнавания некоторых гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз в последовательности вектора ввиду их присутствия в полилинкере с целью использования данных ферментов для молекулярного клонирования.