Плазмидные векторы, второе поколение

Определение "Плазмидные векторы, второе поколение" в ЭБНБ

Второе поколение векторов представляло собой уже искусственно созданные вектора, объединившие в себе черты различных природных плазмид дикого типа. Так, на основе pMB1 было создано небольшое семейство векторов рМВ, среди которых наиболее широкое применение нашла плазмида рМВ9 [Bolivar et al., 1977b]. Она характеризовалась относительно небольшим размером,(около 5,3 тпн), маркерным геном устойчивости к тетрациклину и уникальными сайтами для 4 гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз - EcoRI, BamHI, HindIII и SalI. Причем клонирование по 3 последним сайтам приводило к инактивации гена устойчивости к тетрациклину, что способствовало поиску рекомбинантных клонов, но одновременно требовало проводить селекцию по иммунности к колицину, что, впрочем, было не очень эффективно. Отличительной чертой продвинутых векторов второго поколения стало наличие генов, определяющих устойчивость к двум или даже трем антибиотикам, служивших удобными маркерными признаками.

Наиболее яркими представителями таких продвинутых векторов второго поколения явились векторы семейства pBR, основу которых составили плазмиды pSC101, RSF2124 и pMB1. Непосредственным предшественником плазмиды pBR312, явившейся начальной в серии векторов pBR, стала плазмида рМВ [Bolivar et al, 1977a]. В результате генно-инженерных манипуляций в нее были добавлены ген устойчивости к тетрациклину (из плазмиды pSClOl) и ген устойчивости к ампициллину (транспозон Tni из вектора RSF2124). Таким образом, размер плазмиды pBR312 значительно увеличился - до 10,2 тпн. Дальнейшие процедуры по ее совершенствованию были направлены на уменьшение размера за счет удаления участков молекулы, не несущих важной функциональной нагрузки. За счет уменьшения размера вектора увеличилось число уникальных сайтов для гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз, поскольку в то время размер плазмид и число уникальных сайтов в них (хотя и не строго) были обратно пропорциональны. (Открывшаяся в последующем возможность удаления ненужных сайтов рестрикционных эндонуклеаз нарушила это соотношение.) Другой важной причиной желания экспериментаторов уменьшить размер векторной молекулы являлось то, что частота трансформации и размер вектора находятся также в области обратной зависимости. Так, через промежуточные плазмиды pBR313, pBR318 и pBR320 был получен вектор pBR322, с которым связана целая эпоха в молекулярном клонировании [Bolivar et al., 1977b; Balbas et al., 1986]. Дальнейшие модификации плазмиды pBR322 привели к созданию серии векторов pBR324, pBR325, pBR327, pBR328, и pBR329 [Bolivar et al., 1978]. Некоторые из них были доступны из коммерческих источников и использовались в экспериментах по молекулярному клонированию, но в гораздо меньшей степени, чем плазмида pBR322.

Плазмидный вектор pBR322 объединил в себе такие черты своих предшественников, как репликон рМВ1, ген устойчивости к тетрациклину TcR и ген устойчивости к ампициллину Ap^R. Репликон рМВ1 отличается от репликона ColE1 всего одной инверсией размером 2 пн [Heusterspreute, Davison, 1983] и поэтому часто между ними не делают различий и указывают в качестве репликона вместо pMB1 ColE1. За счет ослабленного контроля репликации, характерного для этих репликонов, копийность плазмиды pBR322 составила уже около 20-50 копий на клетку. Принципиальным отличием плазмид, имеющих такой репликон с ослабленным контролем, является возможность репликации в отсутствие белкового синтеза. Это свойство использовалось экспериментаторами для увеличения копийности плазмид на клетку добавлением в культуральную среду антибиотиков хлорамфеникола или спектиномицина (для векторов, несущих ген устойчивости к хлорамфениколу), подавляющих белковый синтез, и, по некоторым оценкам, при этом число плазмидных молекул увеличивалось на два порядка [Clewell, 1972]. Следует отметить, что ген Tc^R в плазмиде pSC101 является индуцибельным, тогда как при добавлении этого фрагмента в плазмиду pBR322 он был взят без участка, кодирующего один из белков-регуляторов работы данного гена, и его экспрессия стала конститутивной. Такая конститутивная экспрессия имеет некоторое отрицательное значение, однако при этом имеет место уменьшение общего размера вектора.

Первоначально размер плазмиды pBR322 был определен как равный приблизительно 4,3 тпн. За счет такого небольшого размера количество уникальных сайтов в данном векторе было уже значительным. В литературе встречаются различные сведения о числе уникальных сайтов для гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз, имеющихся в плазмиде pBR322, и это связано с тем, что ко времени написания той или иной статьи было известно разное количество таких ферментов. В связи с тем, что продолжается нахождение рестрикционных эндонуклеаз с новыми сайтами узнавания, то правильнее будет ограничиться упоминанием, что таких сайтов все же просто много. Однако более важным является количество уникальных сайтов узнавания гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз, расположенных в генах устойчивости к антибиотикам. Так, в гене, кодирующим устойчивость к тетрациклину, таких сайтов, по крайней мере, 7, а в гене β-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампициллину, их 4. Достаточно большой выбор сайтов рестрикционных эндонуклеаз, расположенных в генах устойчивости к антибиотикам, по которым можно было бы осуществить клонирование и провести дальнейшую селекцию по устойчивости к другому антибиотику, сделало вектор pBR322 очень удобным для экспериментаторов. Например, при клонировании по сайту рестрикционной эндонуклеазы BamHI происходило нарушение гена, кодирующего устойчивость к тетрациклину, и такие рекомбинантные плазмиды приобретали фенотип Ap^R и Tc^S. Колонии, выросшие после трансформации на чашке Петри с ампициллином, пересевали параллельно на две чашки с ампициллином и тетрациклином соответственно, и в результате, те клоны, колонии которых не росли на тетрациклине, были рекомбинантными. Такой тест на наличие вставки, несмотря на дополнительный этап пересева колоний на разные чашки Петри и большой объем рутинной работы, позволил повысить эффективность процедуры клонирования за счет упрощения поиска рекомбинантных клонов. Однако главным и, пожалуй, чуть ли не единственным недостатком плазмиды pBR322 (конечно, как вектора своего времени) было наличие сайта ре-стрикционной эндонуклеазы EcoRI, пригодного для клонирования, но не нарушающего при этом никакой ген и не позволяющего проводить подобный скрининг. Уникальность данной рестрикционной эндонуклеазы заключалась в том, что она была основным ферментом клонирования для плазмидных векторов первого поколения и большое количество клонов было получено с ее использованием. Другими важными причинами ее широкого использования была доступность этой рестрикционной эндонуклеазы из многих коммерческих источников, а также сила привычки экспериментаторов. Уже упоминавшиеся выше вектора pBR325, pBR328, и pBR329, несколько отличаясь между собой по размеру, несли одинаковый важный признак в виде устойчивости к хлорамфениколу, в котором и был расположен уникальный сайт узнавания рестрикционной эндонуклеазы EcoRL Однако ни наличие этого, казалось бы, желанного, сайта узнавания рестрикционной эндонуклеазы EcoRI, ни три гена устойчивости к трем антибиотикам (что, впрочем, не давало особых преимуществ, так как для отбора рекомбинантов достаточно двух маркерных генов устойчивости) не позволили этим векторам превзойти по популярности классическую плазмиду pBR322.

Главной причиной того, что pBR322 в течение целого ряда лет оставалась основным плазмидным вектором для молекулярного клонирования являлось то, что она была первым вектором, полная нуклеотидная последовательность которого была определена [Sutcliffe, 1978]. Первоначально считали, что размер плазмиды pBR322 равен 4362 пн [Sutcliffe, 1978]. Позднее было обнаружено, что в тетрациклиновом гене пропущен один нуклеотид и длина плазмиды pBR322 была принята равной 4363 пн [Peden, 1983]. Однако уточненная последовательность плазмиды pBR322 составляет 4361 пн [Watson, 1988]. Известная нуклеотидная последовательность всего вектора в значительной мере облегчала процедуру рестриктазного картирования вставки и способствовала более точному построению рестриктазных карт клонированных фрагментов ДНК. Знание всей последовательности вектора позволило также локализовать расположение сайтов узнавания для частощепящих рестрикционных эндонуклеаз и рассчитать размеры фрагментов ДНК, получающихся в результате расщепления плазмиды pBR322 данными ферментами, и составить специальные таблицы. Фрагменты плазмиды pBR322, получающиеся в результате ее расщепления некоторыми частощепящими рестрикционными эндонуклеазами, служили в качестве маркерных молекул небольшого размера при проведении электрофореза как в агарозном, так и в полиакриламидном гелях. Наиболее оптимальное распределение полос фрагментов ДНК при разделении гель-электрофорезом характерно для рестрикционных эндонуклеаз Alul, Hinfl, Mspl, а также некоторых других, что и предопределило использование их в качестве маркеров. И если, на сегодняшний день, плазмида pBR322 сдала свои позиции как вектор для молекулярного клонирования, то использование ее рестриктазных фрагментов в качестве маркерных молекул для электрофореза продолжается. Хотя следует отметить активную конкуренцию со стороны специально созданных маркеров, так называемых лестниц, образующих строгую периодичность полос в результате гель-электрофореза, за счет увеличения размера последующих "ступенек" на фиксированные величины, как, например, 50, 100 или 123 пн для разных маркерных "лестниц".

Завершая краткое рассмотрение плазмидных векторов второго поколения, следует подчеркнуть, что это были уже искусственно созданные вектора, но без каких-либо синтетических последовательностей нуклеотидов и с естественным расположением сайтов узнавания для рестрикционных эндонуклеаз, включая гексануклеотидные.