Специализированные векторы для секвенирования днк

Определение "Специализированные векторы для секвенирования днк" в ЭБНБ

В то же время нельзя обойти молчанием ряд специально созданных векторов для секвенирования протяженных фрагментов ДНК, несущих в своем составе различные транспозоны. Так, космидный вектор pAA113X несет транспозон Tn9, позволяющий получать направленные делеции вставки [Ahmed, 1987]. Вектор pAA113M, отличающийся от предыдущего вектора наличием ориджина репликации одноцепочечного фага М13, предназначен для получения одноцепочечных вариантов генерируемых субклонов [Ahmed, 1989]. Недавно был создан весьма совершенный специализированный космидный вектор pAL-F, несущий транспозон ISI, cos-сайты фага лямбда и некоторые другие регуляторные и маркерные участки [Ahmed, Podemski, 1997].

Другой вектор рММ251 также представляет собой весьма сложную конструкцию, в которую встроены регуляторные элементы фага лямбда, инвертированные повторы транспозона Tn3. Механизм получения однонаправленных делеции в данном векторе основан на том, что in vivo происходят делеции с фиксированных точек инвертированных повторов до вариабельных точек соседнего (клонированного) фрагмента ДНК [Sugino, Morita, 1994]. Весьма интересен космидный вектор pDUAL, несущий три гена устойчивости к разным антибиотикам и селективный летальный маркер, а также транспозон Tn1000 [Wang et al., 1993]. Особенностью данного вектора, разработанного для специальной стратегии секвенирования, названной "фабрикой делеции in vivo", является возможность одновременного получения двунаправленных делеционных вариантов, отбираемых по устойчивости к разным антибиотикам. Однако все эти векторы имеют два недостатка. Во-первых, их размер достаточно большой, что создает некоторые неудобства и, во-вторых, что гораздо важнее, осуществление этих делеционных процедур требует использования специальных штаммов Е. coli и весьма сложной схемы их выращивания. Также специального штамма, экспрессирующего фермент рекомбиназу фага лямбда, требует вектор Janus, представляющий собой модифицированный вектор на основе одноцепочечного фага М13 серии mp [Burland et al., 1993]. Отличительной чертой этого вектора является возможность переориентации вставки in vivo и соответственно упаковка разных цепей клонированного фрагмента ДНК. Другой особенностью, связанной с этим вектором Janus™, является то, что его распространением занимается компьютерная фирма "DNASTAR, Inc." (США), а не какая-нибудь специализирующаяся на продаже молекулярно-биологических продуктов, включая векторные молекулы. Объяснением этому может служить местонахождение лаборатории генетики Висконсинского университета, где этот вектор и был сконструирован, и фирмы "DNASTAR, Inc.", расположенных в столице штата Висконсин г. Мэдисон.

Таким образом, для использования всех этих векторов с целью получения делеционных вариантов клонированного фрагмента ДНК in vivo или упаковки в фаговых частицах противоположной цепи ДНК вставки необходимы специфические штаммы Е. coli, что служит некоторым препятствием к их широкому использованию.

Весьма интересен целый набор плазмидных векторов plex00-20, разработанных для мультиплексного секвенирования ДНК и представляющих собой 20 самостоятельных векторов, несущих по два различающихся участка для отжига праймеров [Church, Kieffer-Higgins, 1988]. Таким образом, этот набор векторов, используемых одновременно, несет всего 40 вариантов "тэгов", служащих местами для отжига гибридизационных праймеров и для исключения нежелательной вторичной структуры, состоящих из трех нуклеотидов А, С и Т. Впоследствии на основе одноцепочечного вектора М13 и некоторых из этих векторов, последовательность "тэгов" которых не нарушала рамку считывания галактозидазного гена, сконструировано 11 новых М13р1ех векторов, позволяющих проводить ферментативное мультиплексное секвенирование с одноцепочечными матрицами ДНК [Heller et al., 1991].

Один из ранних векторов рКН47, сконструированный на основе плазмиды pBR322, содержал поли(dА):поли(dТ) дуплексный фрагмент протяженностью около 100 пн, что позволило осуществлять успешное разделение цепей клонированной вставки вместе с векторными последовательностями, одна из которых несла поли(dА)- или поли(dТ)-участки на колонках с олиго(dT)- и олиго(dА)-целлюлозами соответственно [Hayashi, 1980]. Полученные таким образом отдельные цепи клонированного фрагмента ДНК были пригодны в качестве матриц для их секвенирования ферментативным методом.

Сконструированные производные фага М13 М13-100, Ml3-101 и М13-102 несли специальный участок гена X, помещенный под промотор фага Т7 [Guilfoyle, Smith, 1994; Chen et al., 1996; Johnson et al., 1996]. Сверхпродукция данного белка в штаммах Е. coli, продуцирующих фермент Т7 РНК-полимеразу, приводила к репрессии репликации фага, тогда как инсерция в него клонируемого фрагмента ДНК нарушала рамку считывания и позволяла осуществлять прямой отбор рекомбинан-тов. Вектор М13-102 отличался от первого вектора данного семейства Ml3-100 20-нуклеотидным полипуриновым участком для аффинного захвата векторной ДНК и наличием места отжига для универсального секвенирующего праймера, что сделало его более удобным для экспериментаторов [Chen et al., 1996].