Векторы для клонирования пцр фрагментов днк

Определение "Векторы для клонирования пцр фрагментов днк" в ЭБНБ

Появление ПЦР и широкое использование этого процесса для наработки и дальнейшего изучения интересующих исследователей фрагментов ДНК, в том числе, с помощью молекулярного клонирования и секвенирования этих фрагментов, потребовало создания специализированных векторов. Хотя эти векторы и не предназначены непосредственно для секвенирования клонированных продуктов амплификации, но тем не менее они позволяют это сделать и их выделение в отдельный раздел данной главы достаточно оправданно. Обычный подход, рассчитанный на лигирование и клонирование фрагментов ДНК с тупыми концами, показал свою крайне низкую эффективность при работе с ПЦР-фрагментами. Причиной этого является наличие у амплификатов выступающих нематричных нуклеотидов на 3'-концах, образующихся за счет нематричной активности Taq ДНК-полимеразы, присоединяющей по одному дополнительному нуклеотиду, которым преимущественно является остаток аденина [Clark, 1988].

Большинство таких векторов, получивших из-за выступающих тимидинов на своих 3'-концах обозначение Т-векторов и предназначенных для клонирования ПЦР-фрагментов, приобретают свою специализацию в процессе линеаризации обычного вектора путем некоторых дальнейших превращений, но есть и такие, которые содержат специально сконструированные участки в полилинкере. Таким образом, создание Т-векторов достигается различными способами. Например, использование той же нематричной активности Taq ДНК-полимеразы позволило создать специальный вектор с выступающими на 3'-концах дТМФ, пригодный для клонирования в нем таких амплификатов [Marchuk et al., 1991]. В цитируемой работе фагмидный вектор pBluescript [Stratagene, США] расщеплялся рестрикционной эндонуклеазой EcoRV, генерирующей тупые концы, и инкубировался с Taq ДНК-полимеразой в присутствии только одного дТТФ, так что у фермента просто не было выбора в использовании того или иного нуклеотида и он был вынужден добавлять в качестве нематричного нуклеотида менее "любимый" им дТМФ. Было описано получение подобных векторов, но уже с ddT-концами с помощью терминальной трансферазы, правда при последующем лигировании вектора и амплификата образовывались "ники" [Holton, Graham, 1991]. Этой же цели - созданию Т-вектора служили специальные Т-кассеты, представляющие собой два комплементарных олигонуклеотид, несущих на одном конце "липкий" конец, пригодный для лигирова-ния с вектором, расщепленным соответствующей рестрикционной эндонуклеазой, а на другом выступающие дТ-нуклеотиды, позволяющие осуществить лигирование с фрагментами ДНК, полученными в ходе ПЦР и несущими соответственно выступающий дАМФ [Iwahana et al., 1994].

Другой способ приготовления вектора, несущего на своих 3'-концах выступающие дТМФ, заключался в его расщеплении уникальной рестрикционной эндонуклеазой ХстI, два сайта узнавания которой находились в специально созданном полилинкере [Kovalic et al., 1991; Harrison et al., 1994]. Уникальность этой рестрикционной эндонуклеазы, имеющей сайт узнавания 5'-CCANNNNN^ΔNNNNTGG-3', заключается в том, что после расщепления ДНК образуются концы с одним выступающим нуклеотидом, который теоретически может быть любым, поскольку в центральной части сайта расположены незначащие нуклеотиды. Это дало возможность синтезировать участок полилинкера с отличающимися нуклеотидами в двух сайтах узнавания этого фермента таким образом, что вектор после линеаризации становился специализированным Т-вектором для клонирования амплификатов.

Целую линейку специальных векторов (pCR-XL-TOPO, pCR2.1-TOPO, PTrcHis2-TOPO, pBAD-TOPO, pMT/V5-His-TOPO, pcDNA3.1/CTFP-TOPO, pcDNA3.1/NTFP-TOPO) для клонирования амплификатов поставляет фирма "Invitrogen" (США). Выступающие Т-нуклеотиды у этих векторов, имеющих, кроме клонирования продуктов ПЦР, каждый свое предназначение, образуются под действием топоизомеразы I [Shuman, 1994]. Реакция "лигирования", протекающая без ДНК-лигазы, завершается всего за 5 мин и в результате трансформации более 90-95% колоний оказываются рекомбинантными.