Радиоавтография секвенирующего геля

Определение "Радиоавтография секвенирующего геля" в ЭБНБ

Прямая радиоавтография

Возникновение фотографического изображения в результате экспонирования секвенирующего геля, содержащего радиоактивно меченные фрагменты ДНК, на рентгеновскую пленку заключается в воздействии β-частиц на кристаллы галогенидов серебра и их последующего превращения в металлическое серебро. Различают прямую и непрямую радиоавтографию. При прямой - фотографическое изображение возникает только благодаря β-частицам, испускаемым радионуклидом. Прямая радиоавтография секвенирующих гелей может проводиться при комнатной температуре с любым из применяемых для мечения ДНК радионуклидов 32Р, 33Р или 35S (характеристики данных радионуклидов приведены в Приложении). Однако низкой энергии β-частиц двух последних хватает на превращение галогенидов серебра, содержащихся только в первом эмульсионном слое двусторонних пленок, непосредственно контактирующем с гелем, а второй слой для них остается недосягаемым, что и показано на сильно упрощенном схематичном рис.

Радиоавтография с усиливающим экраном

При этом чувствительность процесса по сравнению с использованием 32Р уменьшается, но одновременно увеличивается разрешающая способность метода, так как ввиду более узких зон почернения на радиоавтографе "чтение" полос ДНК может продолжаться в верхней части дальше обычного, β-частицы 32Р обладают достаточно большой энергией и способны вызвать превращение галогенидов серебра в металлическое серебро в обоих эмульсионных слоях двусторонней рентгеновской пленки, но, как видно из рис., при этом будет иметь место увеличение ширины полос ДНК и, как следствие, некоторое ухудшение разрешающей способности метода.

При непрямой радиоавтографии, кроме тех же β-частиц, дополнительное воздействие оказывают кванты света, излучаемые возбужденным (β-частицами) сцинтиллятором. Так, использование для усиления изображения специальных усиливающих экранов, содержащих сцинтилляторы и превращающих энергию β-частиц в кванты видимого света, позволило повысить чувствительность процедуры радиоавтографии примерно на порядок за счет дополнительного засвечивания второго эмульсионного слоя, обращенного к экрану [Laskey, Mills, 1977]. Наиболее типичным экраном является экран, содержащий вольфрамат кальция, обладающий сцинтилляционными свойствами, причем испускающим свет в коротковолновой части спектра, чьи фотоны обладают большей энергией и оказывают более эффективное фотохимическое действие на микрокристаллы галогенидов серебра. Следует отметить, что использование усиливающих экранов возможно только с высокоэнергетическим 32Р. Применение усиливающих экранов приводит к ухудшению четкости полос ДНК за счет еще большего расширения зоны образования металлического серебра под действием квантов света, что и показано на рис. Таким образом, к сожалению, усиливающие экраны затрудняют "чтение" полос ДНК в верхней части геля и вследствие этого сокращают количество достоверно "читаемых" нуклеотидов.

Было предложено интересное применение усиливающего экрана для одновременной детекции в одном геле разных образцов ДНК, меченных сильным (32Р) и слабым (33Р) радионуклидами [Краев и др., 1992]. Сущность такой одновременной детекции заключается в экспозиции секвенирующего геля сразу на две рентгеновские пленки, несущих одностороннюю эмульсию. Одна из этих пленок своим эмульсионным слоем направлена к усиливающему экрану, и образование металлического серебра в ней вызывается только высокоэнергетическими β-частицами 32Р, тогда как первая пленка, направленная эмульсионным слоем к гелю, регистрирует оба образца ДНК и для "чтения" нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, меченного 33Р, остается только вычесть лишние полосы, совпадающие с таковыми на второй пленке.

Более редкие (и сейчас практически неприменяемые) случаи импрегнирования различных сцинтилляторов в секвенирующий гель после завершения электрофореза или в капроновой фильтр, на который перенесены меченые фрагменты ДНК из секвенирующего геля, позволяют использовать для этой цели, кроме 32Р, и более слабые 33Р или же 35S, но при этом также имеет место уменьшение четкости фотографического изображения.

Так, непрямая радиоавтография обеспечивает более высокую чувствительность при более низком разрешении и в случае секвенирования ДНК менее пригодна. Другим отрицательным моментом является необходимость проведения непрямой радиоавтографии при температуре -70°С. Причиной этого является то, что пролет одной β-частицы приводит к превращению десятков или даже сотен ионов серебра в атомы серебра, тогда как требуется несколько квантов света для подобного превращения только единственного иона серебра. Однако, как известно, единичные атомы серебра нестабильны и могут обратно перейти в ионную форму. Понижение температуры экспозиции до -70°С замедляет этот процесс и повышает вероятность образования стабильной пары атомов серебра. Радиоавтография при -70°С преэкспонированной с помощью короткой вспышки рентгеновской пленки дополнительно увеличивает чувствительность процесса [Laskey 1980; Laskey, Mills, 1977], но требует весьма трудоемкого этапа подготовки подобной пленки.

Во избежание недоразумения считаем необходимым заметить, что β-частицы, испускаемые радиоизотопом, не летят только к рентгеновской пленке, как показано на рис., а, в действительности, вылетают во всех направлениях. Ввиду разной энергии отдельных β-частиц и эффекта торможения их самим гелем и содержавшейся в нем водой (в случае радиоавтографии влажных гелей) далеко не все частицы, вылетевшие под более острым углом к рентгеновской пленке, требующим преодоления большего расстояния, достигают эмульсионного слоя. Более того, полет β-частиц даже в воздухе не прямолинеен и траектория их полета представляет собой изломанную линию из-за столкновений с орбитальными электронами встречных атомов. Так, отклоняясь многократно от первоначального направления, β-частица может полететь даже в обратном направлении. А среди долетевших до рентгеновской пленки не все остаются способными произвести в нем необходимое число превращений микрокристаллов галогенида серебра для формирования фотоизображения при последующей проявке. Таким образом, разная энергия отдельных β-частиц позволяет им достичь рентгеновскую пленку на различном расстоянии от места вылета, что и определяет ширину зоны образования металлического серебра, как схематично показано на рис. для 32Р, 33Р и 35S.

В первоначальных экспериментах гели после завершения электрофореза без каких-либо дополнительных процедур оборачивали тонкой пленкой Saran Wrap для предотвращения подсыхания и для исключения контакта влажного геля с желатиновым слоем рентгеновской пленки придавливали тяжелым (свинцовым) грузом и помещали в морозильную камеру с температурой около -20 °С [Maxam, Gilbert, 1977]. Низкая температура требовалась для недопущения диффузии полос ДНК, которая могла ухудшить и без того не очень качественный радиоавтограф геля. Требования по повышению общей производительности метода секвенирования ДНК не могли не затронуть этап радиоавтографии и его различные составляющие.

Так, один из путей увеличения числа "читаемых" полос ДНК состоял в соответствующей подготовке полиакриламидного геля после завершения электрофореза к радиоавтографии. Исключение диффузии фрагментов ДНК, достигаемое их фиксацией с помощью уксусной кислоты, и одновременное удаление мочевины позволили несколько повысить чувствительность и разрешающую способность метода. Более значительное улучшение было достигнуто путем удаления воды и экспонированием предварительно высушенного геля.

Другой подход заключался в применении радиоактивных изотопов с меньшей энергией их β-частиц, таких как 35S и затем 33Р [Biggin et al., 1983; Краев, Миронов, 1990; Zagursky et al., 1991; Краев и др., 1992]. Применение 32Р, имеющего β-частицы с максимальной энергией 1,709 МэВ, приводило к образованию на радиоавтографе широких и диффузных полос ДНК. β-частицы 35S, максимальная энергия которых приблизительно на порядок меньше, чем у 32Р, вызывали появление острых и четко очерченных полос, однако необходимость более длительной экспозиции являлась некоторым недостатком. Еще более удобным оказалось использование изотопа 33Р [Краев, Миронов, 1990; Zagursky et al., 1991; Краев и др., 1992; Barnard et al., 1994]. Максимальная энергия β-частиц 32Р несколько выше, чем у серы, и вполне достаточна для относительно короткого времени экспозиции, сравнимого с таковым для 32Р, и при этом дает такие же резко очерченные полосы ДНК, как и в случае с 35S, что позволяет уверенно проводить "чтение" нуклеотидов в верхней части радиоавтографа.
Еще одна возможность повысить эффективность процедуры радиоавтографии была реализована путем разработки новых типов рентгеновских пленок.