Перенос днк из геля на фильтры

Определение "Перенос днк из геля на фильтры" в ЭБНБ

В настоящее время перенос фрагментов ДНК из секвенирующего геля на мембранные фильтры преследует обычно несколько иные цели, чем тогда, когда этот метод только разрабатывался. Так, в большинстве случаев перенос ДНК из геля на фильтры осуществляется для последующей визуализации полос ДНК с помощью нерадиоактивной колориметрической или хемилюминесцентной детекции, описанной выше в разделе 2.6. Причем вкупе с мультиплексным секвенированием возможно последовательное многократное проведение этапов молекулярной гибридизации с определенным зондом, несущим ту или иную метку; визуализация ДНК зонда после ее гибридизации с ДНК, находящейся на фильтре; удаление зонда и проведение аналогичных этапов со следующим зондом. С фрагментами ДНК, находящимися в полиакриламидном геле, проведение подобных процедур принципиально невозможно и поэтому перенос фрагментов ДНК из секвенирующего геля на мембранные фильтры занимает важное место в арсенале современной молекулярной биологии.

Предложенный в 1984 г. метод геномного секвенирования был основан на выявлении определенных последовательностей ДНК путем их гибридизации с меченным зондом [Church, Gilbert, 1984]. Для осуществления такой гибридизации была необходима процедура переноса фрагментов ДНК из полиакриламидного секвенирующего геля на нейлоновый фильтр. Перенос даже небольших фрагментов ДНК из полиакриламидного геля на мембранные фильтры за счет капиллярных сил малоэффективен и поэтому в данной работе, учитывая большие размеры геля, была сконструирована специальная камера для электропереноса.

Оригинальным подходом к переносу фрагментов ДНК после их разделения в секвенирующем полиакриламидном геле можно считать предложенный в том же 1984 г. метод прямого электрофоретического блоттирования, требующего, впрочем, специально изготовленного аппарата для секвенирования ДНК довольно необычной конструкции [Beck, Pohl, 1984]. Принцип метода заключается в постоянном движении нейлоновой мембраны через нижнюю электрофоретическую камеру, сопровождающимся ее постоянным тесным контактом с нижним срезом геля. Таким образом, фрагменты ДНК, отличающиеся один от другого на один нуклеотид, выходя из геля, сорбируются на данной мембране каждый в своих определенных местах. Имеющее место при таком способе переноса постоянное трение мембраны о нижний срез полиакриламидного геля приводит к его истиранию и сорбции частиц геля на данном фильтре, что отрицательно сказывается на качестве последующего проявления полос ДНК. Поэтому в одной работе было предложено не допускать касания геля с мембраной, а оставлять у нижнего среза стекла зазор в 2 мм, заполняемый буфером [Dolan et al., 1995]. Поскольку скорость движения мелких и крупных фрагментов ДНК заметно отличается (что на обычном радиоавтографе заметно как уменьшение расстояния между полосами по мере увеличения размеров фрагментов ДНК, которым они соответствуют), то программируемое изменение скорости движения мембранного фильтра вдоль нижнего среза геля позволяет в некоторой степени решить эту проблему. Оказавшийся очень удобным такой способ одновременного разделения фрагментов ДНК и их переноса на мембранный фильтр привел к созданию изготовленных фабричным способом подобных приборов. Так, фирма "Hoefer Scientific Instruments, Inc." начала выпуск прибора, названного как "непосредственно блоттирующий секвенер", а фирма "GATC GmbH" выпускает две подобные модели, различающиеся размером стекол и, как следствие, количеством потенциально разрешаемых нуклеотидов.

Попутно следует отметить, что несмотря на то, что перенос ДНК из секвенирующего геля путем прямого блоттирования имеет главной целью возможность нерадиоактивной детекции полос ДНК, тем не менее нет каких-либо препятствий для разделения радиоактивно меченных фрагментов ДНК и последующей радиоавтографии уже не геля, а самой нейлоновой мембраны на рентгеновскую пленку. Более того, четкость полос на радиоавтографе обычно бывает значительно выше ввиду того, что радиоактивная ДНК находится на поверхности самой мембраны, а не в толще геля как при обычной радиоавтографии и, таким образом, не происходит дополнительного рассеяния β-частиц. Единственное, за чем необходимо следить экспериментатору, так это, чтобы к рентгеновской пленке была обращена именно та сторона мембраны, на которой и сорбирована ДНК, в противном случае четкость полос будет заметно хуже.

Другой способ переноса фрагментов ДНК из секвенирующего полиакриламидного геля на мембранный фильтр можно назвать вакуумным блоттированием [Gross et al., 1988], широко применяемым для обычного переноса ДНК из агарозных гелей (Medveczky et al., 1987; Olszewska, Jones, 1988]. Для эффективного переноса фрагментов ДНК из секвенирующего полиакриламидного геля была применена комбинация диффузии полос ДНК, осуществляемой под действием вакуума, а также осмотического градиента, поскольку концентрация буфера в нижнем слое бумаги превышала таковую в верхнем слое в 10 раз. В качестве такой конструкции с источником вакуума служил обыкновенный сушитель геля подходящего размера, на поверхности фильтра из пористого полиэтилена которого размещалось сначала несколько слоев бумаги ЗММ, смоченной в высокосолевом буфере, затем нейлоновый фильтр, сам гель, один слой бумаги 540 и несколько слоев бумаги ЗММ с низкой концентрацией буфера. Сверху весь этот "сэндвич" закрывался листом силиконовой резины и подавался вакуум. Авторы сообщают о переносе фрагментов ДНК размером до 310 нуклеотидов с 40-50%-ной эффективностью в течение 90 мин, однако эффективность переноса фрагмента размером 872 нуклеотида даже после 16 ч не превышала 6% (4% после 90 мин).

Был предложен и более быстрый способ переноса, завершаемый всего за 10 мин, но при этом требующий специального оборудования, поставляемого фирмой "Hoefer" [Patel, Nash, 1995]. Центральными элементами данного прибора, позволяющего осуществлять "полусухой" перенос фрагментов ДНК из секвенирующего геля на нейлоновую мембрану, являются катодный и анодный электроды. В качестве катодного, отрицательно заряженного, электрода служит пластина из нержавеющей стали, на которую помещается слой фильтровальной бумаги и затем пластина геля. На гель накладывается мембранный фильтр и опять слой бумаги. Верхний - анодный, положительно заряженный, электрод выполнен в виде подвижной ниобиевой проволоки, покрытой платиной. После подачи напряжения с помощью встроенного в данный прибор низковольтного источника питания, но развивающего большую силу тока (до 2А), анодный электрод передвигается по верхнему слою бумаги и, таким образом, происходит локальный "полусухой" электроперенос фрагментов ДНК. Проведенное сравнение авторами цитируемой работы полноты переноса данным методом и классическим переносом под действием капиллярных сил показало, что после 10 мин "полусухого" переноса в геле не остается никаких фрагментов ДНК, тогда как количество ДНК в геле после двухчасового обычного переноса визуально изменилось очень незначительно.

Не рассматриваемые здесь методы фиксации фрагментов ДНК на фильтрах в значительной степени зависят от последующих предполагаемых экспериментов с этим мембранным фильтром, от его типа и могут находиться в диапазоне от их не фиксирования вообще, простого выдерживания при температуре 80 °С до облучения УФ-светом или обработки в микроволновой печи. Хотя, надо заметить, что при многократных последовательных этапах гибридизации, проявления и отмывки, необходимых в методе мультиплексного секвенирования, очень важное значение приобретает прочность фиксации секвенированной ДНК на мембранном фильтре. В связи с этим в некоторых работах определялась пригодность для данных целей различных мембранных фильтров и способов фиксации на них фрагментов ДНК [Creasey et al., 1991; Olesen et al., 1993]. Отмечается, что лучшее соотношение выявляемого сигнала по отношению к фону демонстрируют заряженные нейлоновые фильтры, тогда как для нитроцеллюлозных и поливинилиден, дифлуоридных характерно гашение хемилюминесценции [Beck, 1993a, б].