Циклическое секвенирование ДНК


Значение термина Циклическое секвенирование ДНК в Энциклопедии Научной Библиотеки



Циклическое секвенирование ДНК - В отдельных случаях очень трудно отнести тот или иной процесс к определенному типу ПЦР-секвенирования ДНК. Хотя, следует сказать, что в последнее время
Схема циклического секвенирования ДНК
стали появляться работы, в которых описываются процессы, когда действительно происходит накопление продуктов секвенирующих (терминирующих) реакций и одновременное экспоненциальное увеличение числа амплифицируемых и секвенируемых молекул.

Главное отличие циклического секвенирования ДНК от большинства описанных в предыдущем разделе, пожалуй, заключается в особенностях проведения терминирующих реакций. Так, прямое секвенирование фрагментов ДНК, полученных в ходе ПЦР, может проводиться с помощью любой ДНК-полимеразы, включая и нетермостабильную секвеназу. Причиной тому служит весьма значительное количество матрицы ДНК, позволяющей осуществить ее детекцию в секвенирующем геле. А ПЦР в данном случае просто служит для наработки необходимого количества сначала двуцепочечной, а затем и одноцепочечной ДНК. Секвенирование же ДНК с помощью так называемой линейной ПЦР осуществляется посредством циклических этапов денатурации, отжига одного праймера и удлинения цепи в условиях ее терминации дидезоксинуклеотидами, причем последние присутствуют в смеси, начиная с первого цикла (рис.). Ввиду того, что в этих случаях происходит амплификация ДНК только в арифметической прогрессии (не приводящая даже к образованию полноразмерных продуктов), то исходным материалом, несущим изначально довольно большое число копий секвенируемого фрагмента, может служить, например, ранее клонированная ДНК. С помощью всего 30 циклов становится возможным получение такого количества продуктов реакции амплификации/терминирования, которое уже будет видно после электрофоретического разделения в секвенирующем геле.

Примером подобных работ может служить статья Мюррея, где им был секвенирован участок около 200 пн ранее клонированного крупного фрагмента ДНК, причем следует отметить, что в реакцию линейной амплификации были взяты несколько заниженные, против обычного, концентрации дНТФ, что было необходимо для снижения, в свою очередь, концентраций ддНТФ и поддержания требуемых соотношений между ними для эффективного построения цепей ДНК в условиях терминации [Murray, 1989]. Другие авторы секвенировали с помощью линейной ПЦР клонированные фрагменты ДНК, взятые из единичных фаговых бляшек (лямбда или М13) или бактериальных колоний [Krishnan et al., 1991]. Таким образом, в этих работах и им подобных, метод ПЦР был использован исключительно с одной целью - не нарабатывать значительное количество ДНК, необходимое для секвенирования, с помощью обычных процедур выращивания фагов или бактерий, что, впрочем, позволяет сильно экономить время, поскольку выращивание бактерий или фагов и последующая очистка ДНК может занять более суток, тогда как с помощью ПЦР требуемое количество ДНК можно получить через 2-3 ч. Аналогичный подход был продемонстрирован Ли, которым была проведена сначала обычная ПЦР, где в течение 30 циклов нарабатывались целевые продукты амплификации и затем после очистки в агарозном геле фрагмент ДНК, предназначенный для секвенирования, в количестве всего 0,05 пмоль подвергался новым 25 циклам линейной амплификации с одним праймером в присутствии дидезокси-терминаторов [Lee, 1991]. Столь малого количества матрицы ДНК (приблизительно в 10 раз меньше, чем обычно) оказалось достаточно, чтобы после 25 циклов стало возможным "чтение" нуклеотидной последовательности ДНК с радиоавтографа геля.

Интересное решение для построения только одной из присутствующих в реакционной смеси в равном соотношении цепей заключается в эксплуатации ранее показанного принципа температурной асимметричной ПЦР [Mazars et al., 1991]. Так, на первом этапе наработки ПЦР-продукта для секвенирования амплификация проводилась с использованием более коротких праймеров, тогда как этап терминации в присутствии дидезокситрифосфатов проводился путем удлинения секвенирующего праймера, комплементарного одной из цепей и имеющего большую протяженность и более высокую температуру отжига (на 10°С), что исключило на этой стадии из реакции короткие амплификационные праймеры [Liu et al., 1993]. Это позволило авторам осуществить секвенирование фрагмента ДНК, не прибегая к предварительной очистке ПЦР-продукта. Более того, поскольку в ходе секвенирования в этом случае не происходит ферментативного удлинения более коротких амплификационных праймеров из первой реакции, появляется возможность применить метод внутреннего мечения продуктов терминирующей реакции, а не готовить заранее секвенирующий праймер, меченный по своему 5'-концу.

Что касается секвенирования с помощью линейной ПЦР неклонированных фрагментов геномной ДНК без этапа их предварительной экспоненциальной амплификации, было показано, что требуется проведение более двухсот циклов для наработки необходимого количества ДНК, которое можно будет затем детектировать гель-электрофорезом [Cairns, Murray, 1994]. В цитируемой работе потребовалось провести 213 циклов, чтобы амплифицировать фрагмент гена β-глобина человека из исходного количества 5-10 мкг тотальной ДНК, выделенной из белых кровяных клеток. При этом лестница секвенируемых полос ДНК детектировалась не стандартной радиоавтографией, а высокочувствительным прибором Phosphorlmager (Molecular Dynamics, США). Известно, что большое число циклов ПЦР часто приводит к возникновению гетерогенных продуктов амплификации [Bell, DeMarini, 1991], однако Кайрнс и Мюррей связывают отсутствие значительного числа таких фрагментов в их работе с включаемыми ддНМФ в процессе синтеза новых цепей ДНК, тогда как после 50-75 циклов линейной ПЦР без присутствия ддНТФ ими отмечено увеличение числа неспецифических фрагментов ДНК.

Интересен метод "спаренной" амплификации и секвенирования, решающий сразу проблему наработки целевого продукта путем обычной ПЦР и образования специфически терминированных меченых фрагментов ДНК, пригодных для их разделения секвенирующим гель-электрофорезом [Ruano, Kidd, 1991]. В цитируемой работе на первой стадии в течение 15 циклов проводилась экспоненциальная амплификация целевого фрагмента ДНК в присутствии относительно низкой концентрации дНТФ (по 10 мкмоль каждого). Затем на второй стадии в реакционную смесь, поделенную пополам, добавлялись меченые амплификационные/секвенирующие праймеры (в каждую пробирку - по одному). В свою очередь, содержимое этих пробирок делилось еще на четыре части с соответствующими дидезокситерминаторами и следующие 15 циклов были посвящены образованию специфически терминированных продуктов. В дальнейшем этот подход после некоторой модификации позволил секвенировать нанограммовые количества исходного фрагмента ДНК [Reynolds et al., 1993].

В то же время остающийся в реакционной смеси после завершения первой стадии ПЦР другой праймер из данной пары теоретически мог обеспечивать и образование нетерминированных полноразмерных фрагментов ДНК, осуществляя, таким образом, их дальнейшее накопление в реакции. Эффективность этого процесса на данной стадии может варьировать от не образования таких фрагментов вообще до заметного увеличения их доли в ходе ПЦР, что в сильной степени зависит от общей длины амплифицируемого фрагмента ДНК и соотношения дНТФ/ддНТФ. Но в любом случае экспоненциального накопления таких полноразмерных продуктов происходить не будет.

В цитируемой выше статье на стадии циклического секвенирования второй праймер специально не добавлялся, а его присутствие было вызвано тем, что он переносился вместе с ПЦР-продуктом и реакционной средой из первой стадии амплификации ДНК. Тогда как в другой работе, посвященной циклическому секвенированию ДНК, в реакционную смесь наряду с основным секвенирующим праймером специально добавлялся и второй амплификационный праймер, что приводило, как назвали его сами авторы, к "полуэкспоненциальному" течению ПЦР [Sarkar, Bolander, 1995]. На приведенной в данной работе иллюстрации наглядно продемонстрировано появление, а затем и заметное улучшение картины секвенируемых полос ДНК в зависимости от количества второго (амплификационного) праймера. Однако для достижения положительного результата в таком полуэксдоненциальном циклическом секвенировании ДНК очень важное значение приобретает правильное соотношение сразу большого числа компонентов реакции, таких как исходное количество амплифицируемого и одновременно секвенируе-мого фрагмента ДНК, праймеров (секвенирующего и вспомогательного амплификационного), дНТФ и ддНТФ.

В описанном выше полуэкспоненциальном циклическом секвенировании ДНК процессы получения все новых копий полноразмерного продукта и образования терминированных цепей ДНК, предназначенных для их последующего секвенирования, происходят одновременно и оказывают очень сильное влияние друг на друга. Так, если будет превалировать второй процесс, то как таковой амплификации, приводящей к резкому увеличению числа молекул полноразмерного фрагмента, не произойдет, следовательно, недостаточное количество матриц ДНК для их копирования в условиях терминации (секвенирования) не позволит выявить эти продукты в секвенирующем гель-электрофорезе. Превалирующий первый процесс, хотя и приведет к заметной амплификации, все же не позволит "увидеть" лестницу секвенируемых полос ДНК по той же причине нехватки конечного продукта в виде специфически терминированных фрагментов ДНК. Поэтому идеальным вариантом можно было бы считать некое разобщение этих двух, одновременно протекающих в одной пробирке процессов - построение новых цепей ДНК (амплификация) и специфическое терминирование продуктов удлинения праймера (секвенирование).

Создание новой термостабильной ДНК-полимеразы-термосеквеназы - и ей подобных - позволило разработать новый подход к циклическому секвенированию ДНК и в какой-то степени разобщить эти два процесса. Это стало возможным благодаря появившемуся у термосеквеназы свойству с высокой эффективностью включать в растущую цепь ДНК ддНМФ. Таким образом, присутствие в реакционной (амплификационной и одновременно секвенирующей) среде сразу двух термостабильных ДНК-полимераз, резко отличающихся по своей способности использовать в качестве субстрата ддНТФ, сделало возможным одновременную амплификацию ДНК и ее секвенирование [van den Boom et al., 1997; Kilger, Paabo, 1997a; Kilger, Paabo, 1997b]. Так, обычная Taq ДНК-полимераза "отвечает" за наработку полноразмерного продукта (амплификацию), поскольку низкая эффективность включения ею в растущую цепь ДНК ддНМФ приводит к образованию в реакционной смеси все новых копий таких молекул (рис.). Термостабильная F667Y ДНК-полимераза эффективно включает во вновь строящуюся ДНК ддНМФ, приводя к специфической терминации цепей (секвенированию). Данный подход был назван авторами как DEXAS (Direct Exponential Amplification and Sequencing) - прямая экспоненциальная амплификация и секвенирование [Kilger, Paabo, 1997b]. Использование меченого секвенирующего праймера позволяет затем детектировать эти терминированные фрагменты ДНК с помощью гель-электрофореза. Возможно секвенирование и обеих цепей ДНК при использовании биотиновой метки и твердой фазы в виде магнитных частиц со стрепта-видином [van den Boom et al., 1997].

Если успешное протекание всего процесса в ранее описанных подходах циклического секвенирования ДНК зависит, прежде всего, от правильного соотношения таких ингредиентов реакции, как количество исходной матрицы ДНК, праймеров, дНТФ и ддНТФ, а количество самого фермента ДНК-полимеразы не играет особой роли, то в процессе прямой экспоненциальной амплификации и секвенирования с помощью двух разных ДНК-полимераз очень большое значение приобретает именно их соотношение, что было наглядно продемонстрировано в работе Килгера и Паабо [Kilger, Paabo, 1997a].

Важным преимуществом циклического секвенирования является возможность использования в качестве матрицы гораздо меньших количеств ДНК по сравнению с таковыми при обычном секвенировании и часто даже не требующих какой-либо очистки. Так, в литературе сообщается о проведении циклического секвенирования с препаратами ДНК, выделенными из единичных колоний бактерий [Wilson et al., 1990; Hofmann, Brien, 1991; Krishnan et al., 1991; Kilger et al., 1997], из фаговых бляшек [Smith et al., 1990; Wilson et al., 1990; Krishnan et al., 1991; Wang et al., 1995], а также из грубого лизата фага лямбда [Lasham, Darlison, 1993], космидного клона [Dugaiczyk et al., 1992] или клонированных в бактериофаге PI [Benes et al., 1997], или в специальном ВАС-векторе на основе бактериальной искусственной хромосомы (Bacterial Artificial Chromosome) [Kim et al., 1997]. Как мало надо ДНК, чтобы осуществить циклическое секвенирование, показывает работа, в которой в качестве стартового количества служили "крохи" ДНК, сорбировавшейся на зубочистке, просто воткнутой в интересующую полосу ДНК, разделенную агарозным гель-электрофорезом [Kadokami et al., 1995]. Однако авторы рекомендуют втыкать зубочистку в полосу ДНК по крайней мере 3 раза и, учитывая все же малое количество сорбировавшейся ДНК, увеличить число циклов при последующем секвенировании до 40.

Время, затрачиваемое на проведение терминирующих реакций при циклическом секвенировании, обычно значительно больше, чем при стандартном секвенировании. Однако есть сообщения о циклическом секвенировании ДНК, где терминирующие реакции были завершены всего за 25 мин вместо обычных 2 ч [Swerdlow et al., 1993], что, впрочем, потребовало использования специального прибора Rapidcycler, выпускаемого фирмой "Idaho Technology Inc." (США). Данный прибор позволяет за счет высокой скорости смены температур проводить 30 циклов за 10 мин в специальных капиллярах, обдуваемых потоками воздуха [Wittwer et al., 1990,1994]. Для определения последовательности 300 нуклеотидов путем циклического секвенирования другим авторам потребовалось всего 18 мин на 30 циклов в ДНК-амплификаторе очень оригинальной конструкции [Nakano et al., 1994]. Главной особенностью данного прибора является то, что полимеразная реакция протекает не как обычно в пробирке, а в постоянном потоке жидкости, за счет специального пневматического насоса движущейся по тефлоновому капилляру, отдельные отрезки которого помещены в масляные бани с соответствующими температурами денатурации ДНК, отжига праймеров и построения новых цепей.

В то же время быстрота смены температур при циклическом секвенировании требуется не всегда. Хорошим примером этому служит использование в циклическом секвенировании коротких праймерных молекул. Использование в циклическом секвенировании какой-либо термостабильной ДНК-полимеразы накладывает определенные ограничения на олигонуклеотидные праймеры, которые должны иметь достаточно высокую температуру отжига, чтобы формировать затравочный комплекс с матрицей ДНК в условиях проявления термостабильной ДНК-полимеразой своей ферментативной активности. Так, в циклическом секвенировании наиболее часто используемая температура отжига праймеров колеблется между 55° и 65°С, что достигается или их повышенным GC-составом, или некоторым увеличением длины. Таким образом, использование более коротких олигонуклеотидных праймеров из предсинтезированных библиотек для осуществления секвенирования ДНК путем праймерной "прогулки" становится практически невозможным. Однако в одной работе было показано, что длительный отжиг короткого нонамерного праймера при 20°С в течение 5 мин и затем медленное (в течение еще 5 мин) повышение температуры до 60°С все же позволяют термостабильной ДНК-полимеразе за все это время несколько удлинить праймер, повысив тем самым температуру его диссоциации [Bock, Slightom, 1995]. В этой работе был, таким образом, исследован 121 нонамерный праймер из предсинтезированной библиотеки и около половины из них показали хорошие результаты в циклическом секвенировании. Разработанный способ ферментативного дифференциального удлинения коротких праймеров с помощью неполного набора дезоксинуклеотидтрифосфатов, описанный в разделе 2.3, также сделал возможным использование в циклическом секвенировании коротких 8-мерных олигонуклеотидных праймеров [Raja et al., 1997].

При любом методе секвенирования ДНК серьезную проблему представляют ошибки в определении того или иного нуклеотида(ов). При нециклических методах секвенирования большинство ошибок возникает или из-за компрессии фрагментов ДНК при их разделении в секвенирующем геле, или из-за неспецифической терминации новосинтезируемой цепи ДНК, которая, в свою очередь, может иметь различные причины. В циклическом секвенировании ДНК, кроме этих причин, большое влияние на точность секвенирования оказывает и исходное количество самой матрицы ДНК. Так, было проведено специальное исследование, посвященное выявлению зависимости исходной концентрации матрицы в реакционной смеси и точности секвенирования [Hyder et al., 1994]. В этой работе было показано, что для фрагмента длиной 357 пн наименьший процент ошибок (1-3%) при циклическом секвенировании обнаруживался при изначальном количестве матрицы, варьирующим от 75 до 1125 фмоль. В другой работе, поставившей целью определение точности обычного секвенирования с использованием секвеназы и циклического, проводимого с помощью Taq ДНК-полимеразы, подсчитывали число ошибок, приходящихся на участки матрицы, по-разному удаленные от праймера [Koop et al., 1993]. Так, для первых 350 нуклеотидов количество ошибок не превышало 1%, тогда как дальнейший участок (351-500 нуклеотидов) характеризовался уже 17% ошибок, причем эта тенденция была характерна для обоих ферментов и, следовательно, для обычного и циклического подходов, однако секвеназа характеризовалась все же несколько меньшим числом производимых ошибок.

Циклическое секвенирование ДНК в силу особенности многократного повторяющегося протекания терминирующих реакций может приводить к значительному истощению содержания в смеси какого-либо дНТФ и ддНТФ по причине высокого содержания комплементарному ему нуклеотида в матрице ДНК (при условии изначально одинакового соотношения всех дНТФ, как обычно бывает в коммерческих наборах), приводя к ошибкам. Подобный эффект продемонстрирован при секвенировании А + Т-богатого (более 80%) региона митохондриальной ДНК Schistocerca gregaria, результатом чего стало включение "неправильных" нуклеотидов, когда концентрация дАТФ и дТТФ в терминирующей смеси упала ниже критической, что было выявлено параллельным секвенированием ПЦР-продукта с помощью секвеназы [Zhang, Hewiit, 1994], поскольку преимущественное содержание какого-либо нуклеотида в цепи ДНК в обычном секвенировании практически не заметно. Другими трудными участками для секвенирования считаются гомополимерные треки и повторяющиеся элементы. Так, в одной работе было показано, что для успешного секвенирования динуклеотидных повторов (GT) и СТ-трека потребовалась повышенная температура отжига и более продолжительная денатурация [Robbins et al., 1996]. Было показано, что использование в циклическом секвенировании ДНК реакционного буфера, не содержащего даже остаточных количеств ионов К+, приводит к исчезновению обычных со стандартным буфером "стопов", являющихся следствием неспецифического терминирования цепи [Woodford et al., 1995]. КС1 является весьма распространенным ингредиентом многих буферов хранения различных ферментов и за счет этого его следовые количества попадают в ПЦР-секвенирование. В цитируемой работе отмечается, что, впрочем, любые одновалентные катионы оказывают подобное отрицательное влияние на само течение ПЦР и циклическое секвенирование.

Следует подчеркнуть, что указанные количества ошибок при секвенировании ДНК могут быть присущи только первичному материалу в виде некой последовательности нуклеотидов, выявленной в процессе электрофореза и радиоавтографии. Однако точность определения нуклеотидной последовательности генов и прочих фрагментов ДНК должна составлять на заключительном этапе по крайней мере 99,95%, что достигается повторным (многократным) секвенированием данного фрагмента ДНК, да еще и по обеим цепям. Более строгим стандартом в последнее время считается 99,99%. Таким образом, завершенное секвенирование какого-либо фрагмента ДНК должно привести к последовательности нуклеотидов, допускающей только одну ошибку на 10 000 нуклеотидов.

Кроме наиболее часто используемой термостабильной ДНК-полимеразы из Thermus aquaticus, в циклическом секвенировании применяются и некоторые другие ДНК-полимеразы с подобными свойствами. Так, сообщается об успешном использовании дельта Taq ДНК-полимеразы [Fan, Ranu, 1997], являющейся модифицированной версией этого же фермента с удаленной экзонуклеазной активностью; рекомбинантной AmpliTaq и SequiTherm ДНК-полимераз, поставляемых фирмами "Perkin-Elmer" и "Epicentre Technologies" (обе, США) соответственно [Fulton, Wilson, 1994]. SequiTherm ДНК-полимераза, выделенная из охарактеризованной архебактерии, использовалась и в других работах [Woddford et al., 1994; Zimmermann et al., 1994]. В этой же статье наряду со стандартной Taq ДНК-полимеразой было проведено сравнительное исследование и других термостабильных ДНК-полимераз - Tub ДНК-полимеразы из Thermus flavus, Pfu ДНК-полимеразы из Pyrococcus furiosus, Ventf (exo-) ДНК-полимеразы из Thermococcus litoralis. Проведенное сравнение качества циклического секвенирования ДНК, осуществленного с помощью нативного фермента Tth ДНК-полимеразы и ее модифицированного варианта - дельта Tth ДНК-полимеразы, характеризующейся отсутствием 5' → 3'-экзонуклеазной активности, показало заметное преимущество последней, выражающееся в низком уровне фона [Arakawa et al., 1996]. Ранее этой же группой авторов показано успешное применение в циклическом секвенировании дельта Tth ДНК-полимеразы с использованием в качестве метки биотиновых производных ддНТФ для последующей хе-милюминесцентной детекции [Ikeda et al., 1995]. Из других ферментов можно отметить архебактериальную ДНК-полимеразу Deep Vent® (exo-) из Pyrococcus sp. [Mariame, 1996]. В последней же работе приводится информация о применении после завершения реакций циклического секвенирования терминальной трансферазы, достраивающей все неспецифически (т.е. не дидезоксинуклеотидами) терминированные цепи ДНК, что заметно улучшает качество секвенирования ДНК, как это было показано ранее [Fawcett, Barlett, 1990].

Схема циклического секвенирования ДНК Схема циклического секвенирования ДНК >>>>



Спаренная амплификация и секвенирование фрагмента геномной ДНК Спаренная амплификация и секвенирование фрагмента геномной ДНК >>>>



Прямая экспоненциальная амплификация и секвенирование ДНК Прямая экспоненциальная амплификация и секвенирование ДНК >>>>


читайте так-же
Циклаурская свитаВ начало
буква "Ц"
буквосочетание "ЦИ"
Цикличность

Статья «Циклическое секвенирование ДНК» была прочитана 4466 раз