Твердофазное секвенирование днк

Определение "Твердофазное секвенирование днк" в ЭБНБ

Деление двуцепочечного ПЦР-фрагмента

Разработанные магнитные частицы, покрытые тем же стрептавидином, оказали революционизирующее влияние на дальнейший ход событий. Удобство обращения с ними позволило получать в чистом виде разные цепи ДНК, пригодные для их дальнейшего секвенирования (при условии, что одна из цепей несла метку в виде биотина). В литературе имеется значительное количество статей, описывающих применение магнитных частиц со стрептавидином для секвенирования ДНК [Hultman et al., 1989; Uhlen, 1989; Wahlber et al., 1990; Hultman et al., 1991; Lee, Vacquier, 1993; Verhasselt et al., 1993; Kofoid, 1995; Wang et al., 1995]. Такое секвенирование ДНК с помощью магнитных частиц получило название "твердофазного секвенирования" и используется в настоящее время довольно широко, особенно для определения нуклеотидной последовательности ПЦР-продуктов. Причем следует отметить, что почти все упомянутые в предыдущем разделе методы, направленные на получение одной цепи ДНК продуктов ПЦР, позволяют, как правило, обеспечить только обогащение, в той или иной степени, реакционной смеси какой-то одной цепью. А способ деления цепей, основанный на аффинной сорбции биотинилированной ДНК на магнитных частицах со стрептавидином, обеспечивает практически их 100%-ную очистку, благодаря, во-первых, прочному взаимодействию комплекса биотин/стрептавидин и, во-вторых, легкости разделения фаз (магнитные частицы и водный раствор), в которых и оказываются сосредоточенными разные цепи ДНК (рис.).

Так, в результате проведения ПЦР с олигонуклеотидными праймерами, один из которых несет молекулу биотина на своем 5'-конце, продукты амплификации сорбируются на магнитные частицы (например, Dynabeads M-280 Streptavidin фирмы "Dynal", Норвегия). Далее следует этап отмывки, удаляющий все ставшие ненужными ингредиенты (дНТФ, праймеры и пр.) ПЦР. Затем в результате денатурации с помощью щелочи с магнитными частицами остается связанной только та цепь ДНК, которая была построена путем удлинения биотинилированного праймера, а вторая цепь выходит в раствор. Удерживая магнитом магнитные частицы у боковой стенки пробирки, отбирают раствор, содержащий вторую цепь ДНК. Магнитные частицы промывают от остатков щелочи и после отжига на них соответствующего праймера проводят секвенирующие реакции в присутствии ддНТФ. По их завершении проводится еще один этап денатурации и продукты терминирующих реакций наносятся на секвенирующий гель.

Что касается второй небиотинилированной цепи ДНК, элюированной раньше, то после нейтрализации она может быть также сёквенирована с соответствующим праймером. В качестве нейтрализующего агента предлагается использовать соляную кислоту [Hultman et al., 1991], что, впрочем, требует очень точного соблюдения нужного количества этого реагента. Менее строгие условия возможны при использовании для нейтрализации ЗМ ацетата натрия или 5М ацетата аммония. Другой подход заключается в проведении двух этапов спиндиализа через миниконцентратор Centricon-30 [Lee, Vacquier, 1993]. В литературе описывается использование для денатурации цепей ДНК, сорбированных на магнитных частицах со стрептавидином, гидроокиси аммония, обработка которым проводилась при комнатной температуре [van den Boom et al., 1998]. Далее, после удаления вышедшей в раствор цепи ДНК, биотинилированную цепь ДНК элюировали с магнитных частиц с помощью той же гидроокиси аммония, но при температуре 60° С.

Альтернативой этим процедурам является возможность одновременного использования в ПЦР второго также меченого амплификационного праймера, несущего молекулу дигоксигенина. Таким образом, в результате ПЦР образуются фрагменты, обе цепи которых несут меченые молекулы: одна - биотин, другая - дигоксигенин, что дает возможность после эволюции второй небиотинилированной дигоксигениновой цепи с магнитных частиц осуществить повторную сорбцию этой цепи на новые магнитные частицы с антителами к дигоксигенину и провести дальнейшие процедуры по вышеописанной для биотина схеме. В работе Лоусона и соавт. были исследованы особенности твердофазного секвенирования одноцепочечной матрицы, сорбированной на магнитных частицах, покрытых стрептавидином, разных фирм-производителей и при этом было показано, что добавление в среду 1%-ного казеина способствует уменьшению неспецифического связывания и улучшает качество получаемых результатов [Lawson et al., 1996].

В литературе описан другой оригинальный подход к проведению ПЦР с использованием двух меченых праймеров с последующим секвенированием продуктов реакции. Один из этих праймеров несет молекулу биотина, а второй, в виде своеобразной метки, содержит дополнительный участок размером 21 нуклеотид, представляющий собой lac-оператор [Wahlberg et., 1990]. После иммобилизации ПЦР-продуктов на магнитных частицах со стрептавидином в реакционную смесь добавляется комплекс lac-репрессор (Lacl) и β-галактозидаза (LacZ) и хромо-генный субстрат O-нитрофенил β-D-галактозид, что позволяет выявить нужные образцы для их дальнейшего секвенирования и провести деление цепей с помощью щелочи, как описано выше.

Завершая рассмотрение твердофазного секвенирования, следует еще раз кратко остановиться на преимуществах этого подхода. Так, пожалуй, главное, что обеспечивает аффинная сорбция биотинилированной ДНК на магнитных частицах, покрытых стрептавидином, так это быстрое и высокоэффективное деление цепей секвенируемого фрагмента ДНК, обеспечивающее их практически 100%-ную очистку, и доступность обеих этих цепей в качестве одноцепочечных матриц для ферментативного секвенирования. Кроме этого, сорбция продуктов ПЦР на твердой фазе в виде магнитных частиц позволяет легко удалить ингредиенты реакции амплификации, такие как дНТФ, праймеры, соли. Некоторым недостатком можно считать более низкую эффективность сорбции биотинилированных фрагментов ДНК протяженностью свыше 3 тпн на магнитных частицах со стрептавидином [Wahlberg et al., 1995]. Для преодоления этого было предложено вводить в праймеры множественные биотинилированные метки, приводящие к упрочнению связывания матрицы ДНК с подобными магнитными частицами [Kasai et al., 1992]. В литературе встречаются указания на имеющуюся возможность повторного секвенирования (т.е. проведения терминирующих реакций) биотинилированной цепи ДНК, сорбированной на твердой фазе, после удаления второй вновь синтезированной комплементарной цепи ДНК в случае не совсем удачного результата после первой попытки. Однако, справедливости ради, следует отметить, что для проведения терминирующих реакций в растворе берут, как правило, не все количество имеющейся матрицы ДНК, что также дает возможность повторения этого эксперимента.

Другой аспект использования твердой фазы в секвенировании ДНК заключается в возможности удаления как исходной матрицы, так и прочих ингредиентов реакции, проводимой в растворе, за счет связывания новосинтезированной цепи ДНК, несущей биотинилированный праймер, с магнитными частицами со стрептавидином. Так, в одной работе было показано, что нанесение на секвенирующий гель только новосинтезированной цепи ДНК улучшает качество разделения [Tone, Smith1993].

Еще одной важной особенностью твердофазного секвенирования биотинилированных цепей ДНК, сорбированных на магнитных частицах, является возможность использования этого подхода не только при прямом секвенировании ПЦР-продуктов, рассмотренном выше, но и в экспериментах по циклическому секвенированию ДНК.