Прямое секвенирование пцр-продукта

Определение "Прямое секвенирование пцр-продукта" в ЭБНБ

Асимметричная ПЦР

Прямое секвенирование фрагмента ДНК, полученного в результате амплификации, в значительной мере снимало проблему ошибочно встроенных Taq ДНК-полимеразой нуклеотидов, поскольку в этом случае секвенировался сразу весь пул полученных в ПЦР молекул. Так, при рассмотрении даже самого худшего сценария, где уже в первом цикле в одной из цепей единичной копии нужного гена произошло включение некомплементарного нуклеотида, то по завершении всего процесса ПЦР только около четвертой части всех молекул будет нести эту замену и поэтому его достоверное "прочтение" все же возможно. Допустить то, что в первом же цикле произойдут замены какого-то конкретного нуклеотида и также комплементарного ему в другой цепи ДНК, просто невероятно. Необходимо отметить, что в этом сценарии мы исходили из присутствия в реакционной смеси изначально всего одной копии амплифицируемого фрагмента, что случается крайне редко. Неправильное включение одного и того же нуклеотида в разных матрицах ДНК кажется весьма маловероятным событием и поэтому нуклеотид-ная последовательность, выявляемая прямым секвенированием амплификатов, вполне достоверна. Хотя, все же нельзя исключать каких-то особенностей отдельных участков одноцепочечных матриц ДНК, например, в виде прочной вторичной структуры, сохраняющейся даже при высокой температуре, которая может вызывать в таких местах "сбои" Taq ДНК-полимеразы. Если же включение "неправильного" нуклеотида произойдет в более поздних циклах, то вклад такого ошибочно встроенного нуклеотида может быть даже незаметен. Как уже отмечалось выше, при выявлении гетерогенных нуклеотидов в определенном месте фрагмента нельзя сбрасывать со счетов и возможный полиморфизм исходных молекул ДНК, особенно в случаях секвенирования каких-либо повторяющихся генов или прочих повторов ДНК.

Температурная асимметричная ПЦР

Также следует иметь в виду, что при прямом секвенировании повторяющихся элементов генома, наработанных в ходе ПЦР, будет определяться их некая консенсусная нуклеотидная последовательность. Более того, в случае сильного полиморфизма отдельных участков этих повторов, делеций или вставок одного или нескольких нуклеотидов (что для многих повторяющихся элементов бывает обычным явлением), определение нуклеотидной последовательности таких амплификатов, скорее всего, будет невозможно. Некоторое решение проблемы в подобном случае заключается все-таки в клонировании и последующем секвенировании довольно большого числа независимых амплификатов с тем, чтобы уже на основе их последовательностей составить усредненную, если в таковой будет надобность.

Получение одноцепочечной матрицы

В то же время следует отметить, что в первых работах по секвенированию фрагментов ДНК, наработанных с помощью ПЦР [McMahon et al., 1987; Wrischnik et al., 1987; Engelke et al., 1988], проблемы ошибочно включенных дНМФ не возникало в связи с тем, что для амплификации использовался Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I, характеризующийся довольно высокой точностью синтеза комплементарной цепи ДНК. Особенностью двух последних работ было применение специального секвенирующего внутреннего или "вложенного" праймера, место отжига которого находится в амплифицированном фрагменте. Такой праймер отжигался только на "нужном" амплификате и позволял осуществлять секвенирование в присутствии гетерогенных фрагментов ДНК, полученных в ходе ПЦР и содержащих случайные последовательности. Данный подход в ряде случаев необходим, поскольку олигонуклеотидные праймеры могут отжигаться не только в предполагаемом месте, но и, в силу ряда причин, в каких-либо других местах матрицы ДНК. Так, например, если в первых циклах почему-то произошел отжиг праймеров с участками ДНК, не обнаруживающими с ними полной гомологии, то во всех последующих циклах гомология этого участка у новосинтезируемых цепей ДНК с праймерами будет уже полная. Однако внутренняя последовательность таких ложных амплификатов будет совсем иной, в связи с чем третий праймер на ней не отожжется. Соответственно, если секвенирующий праймер будет одним из амплификационных, то он отожжется на таком амплификате без каких-либо проблем, что приведет к невозможности определения последовательности ДНК, поскольку будет секвенироваться весь пул этих молекул, так как в каждой из них присутствует последовательность этого праймера (частные случаи экспоненциальной амплификации фрагментов ДНК с одним праймером здесь в расчет не принимаются). Надо заметить, что иногда проблема образования в ходе ПЦР гетерогенных фрагментов ДНК может быть решена весьма просто - путем повышения температуры отжига олигонуклеотидных праймеров или изменением состава реакционного буфера. Возможно применение подходов с различными вариантами "горячего старта". Сообщается также о так называемом энхансере специфичности, заключающемся в добавлении в реакционную смесь тетраметиламмониум хлорида [Hung et al., 1990]. Другое кардинальное решение может заключаться в выборе и синтезе новых праймеров.

Создание одноцепочечной матрицы

Определенную проблему в секвенировании двухцепочечных фрагментов ДНК, полученных в ходе ПЦР, составляет то, что на этапе отжига секвенирующего праймера происходит и гибридизация комплементарных цепей данного фрагмента ДНК, приводящая к формированию исходной двуцепочечной молекулы. Этому способствует также и то, что амплификаты, предназначаемые для секвенирования, представляют собой, как правило, не очень крупные молекулы ДНК, следовательно, скорость этого процесса может быть весьма значительной, и требующееся на это время может оказаться сравнимым со временем отжига короткого олигонуклеотидного праймера. Таким образом, имеет место некая конкуренция между олигонуклеотидным праймером и одной из цепей ДНК за место отжига на комплементарной им цепи. Чтобы хоть как-то уменьшить отрицательное влияние этого процесса на секвенирование ДНК, были предложены различные добавки в буфер для отжига. Так, в одной работе рекомендовалось применение 10%-ного диметилсульфоксида [Winship, 1989], в другой - различных неионных детергентов [Bachmann et al., 1990], причем наилучшие результаты показал нонидет NP-40 и твин-20.

Другой отрицательный эффект от присутствия в реакционной смеси второй комплементарной цепи состоит в образовании неспецифических "стопов", происходящих из-за "утыкания" ДНК-полимеразы, удлиняющей нормально отожженый праймер, в двуцепочечный участок матрицы, образовавшийся в результате отжига на ней комплементарной цепи ДНК, тогда как остальная часть цепи оказалась неспаренной, что и дало возможность ДНК-полимеразе до поры, до времени, а точнее, до данного места, осуществлять синтез второй цепи ДНК [Kusakawa et al., 1990; Rao, Saunders, 1992; Rao, 1994]. Подобные места могут быть или произвольно распределены по всей длине матрицы ДНК, или располагаться в некоторых участках, где в силу определенной нуклеотидной последовательности восстановление двуцепочечной структуры происходит особенно быстро [Olsen, Eckstein, 1989]. На заключительном радиоавтографе для таких мест будет характерно наличие полос во всех четырех дорожках, не позволяющее осуществить достоверное "прочтение" этих нуклеотидов. В некоторой степени это можно преодолеть довольно быстрым охлаждением раствора денатурированной матрицы до 12° С в присутствии избытка олигонуклеотидного праймера, поскольку более короткий праймер все же успевает в этих условиях отжечься на комплементарном участке. В этой же работе было показано, что видимый в агарозном геле как единая полоса ПЦР-продукт в действительности, при его анализе в секвенирующем геле, представляет собой достаточно гетерогенную смесь основного продукта и более коротких полупродуктов, причем последние при секвенировании также приведут к упомянутым выше "стопам". В работе других авторов [Casanova et al., 1990] была исследована эффективность секвенирования двуцепочечного ПЦР-продукта в зависимости от времени отжига олигонуклеотидного праймера. Наилучшие результаты были получены в случаях максимально быстрого охлаждения, занимающего всего 15 с, что достигалось путем помещения пробирки с матрицей, денатурированной нагревом в присутствии праймера, на -70° С.

Еще одна проблема секвенирования продуктов амплификации заключается в неиспользованном в ходе ПЦР большом количестве дНТФ и олигонуклеотидных праймеров, что делает невозможным прямое секвенирование ПЦР-продуктов без соответствующих процедур удаления этих ингредиентов. Обычно в ПЦР используется не более 10% праймеров и их избыток вместе со взятой аликвотой для секвенирования, таким образом, перенесется в следующую реакцию. Поскольку в качестве секвенирующего праймера может быть добавлен или третий праймер, или даже один из амплификационных, предварительно меченный по своему 5'-концу, то олигонуклеотидные праймеры из первой реакции не могут сделать секвенирование ДНК невозможным. Но они будут конкурировать с секвенирующим праймером за места отжига, занимать молекулы ДНК-полимеразы и расходовать дНТФ и ддНТФ и за счет этого снижать выход целевого продукта. Все это вместе приведет к ухудшению результатов секвенирования амплификатов.

Избыток дНТФ, перенесенный вместе с ПЦР-продуктом в реакцию секвенирования, представляет даже большую проблему. Обычная концентрация дНТФ в ПЦР составляет 0,2 мМ для каждого нуклеотида. После 25 циклов, как правило, используется около 3% от их исходного количества, что зависит от длины амплифицируемого фрагмента и эффективности всего процесса. Однако такая высокая концентрация дНТФ требуется отчасти из-за небольшой продолжительности этапа удлинения комплементарной цепи ДНК и необходимости его полного завершения, поскольку в противном случае экспоненциальное течение реакции будет невозможно. Таким образом, присутствие очень большого количества дНТФ не позволяет на этапе секвенирования ДНК выполнить необходимые соотношения дНТФ/ддНТФ, поскольку последних придется добавить так много, что проект по секвенированию ДНК с помощью ПЦР и Taq ДНК-полимеразы станет чрезмерно дорогим.

Эффективное секвенирование ПЦР-продуктов требует удаления дНТФ и праймеров из первой реакции, остающихся в избытке после ее завершения, что может быть осуществлено с помощью различных методов, основывающихся, главным образом, на заметной разнице в размерах дНТФ (менее 600 Да), олигонуклеотидных праймеров (в среднем - около 8000 Да и обычно не превышающих 12 000 Да) и самих продуктов ПЦР в виде двуцепочечных фрагментов ДНК, характеризующихся значительно большей молекулярной массой [Gyllensten, 1989]. Достаточно простым способом является осаждение ДНК, полученной в ходе ПЦР, в условиях неосаждения дНТФ и коротких фрагментов ДНК, каковыми являются праймеры. Сообщается об использовании для этой цели полиэтиленгликоля [Kusukawa et al., 1990], количественно осаждающего фрагменты ДНК крупнее 150 пн, тогда как более мелкие он осаждает плохо или совсем не осаждает [Paithankar, Prasad, 1991]. Аналогичное действие оказывает изопропанол. Применяется также ультрафильтрация с пороговыми величинами 30 000 Да [Nichols, Raben, 1994] или 100 000 Да [Krowzczynska, Henderson, 1992], ниже которых ингредиенты предыдущей реакции удаляются. Этот же принцип ультрафильтрации лежит в основе спин-диализа в микроцентрифуге с помощью специальных микроконцентраторов Centricon 30 фирмы "Amicon" (США), продемонстрировавшего эффективное удаление оставшихся в ходе ПЦР дНТФ и олигонуклеотидных праймеров, что позволило провести успешное секвенирование полученного продукта [Gal, Hohn, 1990; Wong et al., 1987].

Следует отметить описанную возможность ферментативного удаления неиспользованного количества праймеров после завершения первой стадии ПЦР с помощью экзонуклеазы VII [Li et al., 1991]. Экзонуклеаза VII проявляет свою активность по отношению к одноцепочечным фрагментам ДНК, начиная одновременный гидролиз как с 5'-, так и с 3'-концов, не оказывая при этом заметного действия на двуцепочечные продукты амплификации. Был предложен и другой подход, требующий, как и при осаждении фрагментов ДНК, только одну пробирку и заключающийся в ферментативном разрушении с помощью экзонуклеазы I и щелочной фосфатазы краба неиспользованных дНТФ и праймеров [Werle et al., 1994]. Метод относительно прост и исключает потерю ДНК во время многочисленных процедур, применяемых при очистке ПЦР-продуктов более сложными методами, описанными ниже.

Как уже отмечалось выше, в ходе ПЦР случается, что образуется смесь гетерогенных молекул ДНК, и тогда простое осаждение или ферментативная обработка, хотя и исключат из дальнейшего этапа секвенирования мешающие дНТФ и праймеры из первой реакции, однако не решат проблему наличия посторонних ДНК. В этой связи было предложено проводить очистку амплификатов с помощью электрофореза в агарозном или полиакриламидном гелях или хроматографией, что одновременно удаляло непрореагировавшие дНТФ и праймеры, а также позволяло в дальнейшем проводить секвенирование именно того фрагмента ДНК, который и был намечен. После проведения электрофоретического разделения дальнейшие процедуры по очистке нужных фрагментов ДНК из геля могут быть практически любыми, начиная от простого замораживания/оттаивания до электроэлюции [Маниатис и др., 1984; Sambrook et al, 1989; Cao, Brosius, 1993]. Описанные в литературе способы выделения фрагментов ДНК из геля, позволяющие осуществить дальнейшее эффективное секвенирование, состоят в их элюции на ДЭАЭ-бумагу [Nickrent, 1994], в разрушении агарозы под действием агаразы [Gold, 1992] или сорбции биотинилированной ДНК (за счет одного из праймеров, несущего биотин) из расплава геля на магнитных частицах со стрептавидином [Green et al., 1990]. Использование других магнитных частиц, покрытых карбоксилом, способных в присутствии полиэтиленгликоля и NaCl обратимо сорбировать ДНК, уже не требовало наличия биотиновой метки [DeAngelis et al., 1995]. Сообщается также о разделении продуктов амплификации в легкоплавкой ага-розе и использовании в дальнейшем секвенировании с помощью секвеназы данного ПЦР-продукта прямо вместе с расплавленным кусочком легкоплавкой агарозы, не прибегая к элюции, что, впрочем, не позволило на этапе мечения снижать температуру инкубации ниже 37° С, во избежание образования при этом в реакционной смеси геля [Kretz et al., 1989; Kretz et al., 1990].

Был предложен интересный подход к элюции ПЦР-фрагмента ДНК из полиакриламидного геля, заключающийся в предварительном высушивании геля, окрашенного бромистым этидием, и с наложенным на него кусочком фильтровальной бумаги, вырезанному по размеру полосы ДНК [Wu et al., 1996]. Далее, поскольку размер фильтровальной бумаги строго соответствовал размеру исследуемой полоски ДНК, то вырезался кусочек сухого полиакриламидного геля, исходя из контуров бумаги. После прогрева в течение 15 мин в микроцентрифужной пробирке этого кусочка геля вместе с бумагой, последняя удалялась центрифугированием. Есть работы, в которых элюция из полиакриламидного геля продукта ПЦР для его последующего секвенирования осуществлялась простой диффузией в солевой раствор в течение ночи [Huber, McMahon, 1988]. Недавно было сообщено об использовании специального небулай-зера (Gel Nebulizer) (Millipore, США) для выделения ПЦР-продукта из агарозного геля, пригодного для последующего его секвенирования [Leonard et al., 1998]. Это устройство представляет собой своеобразную колонку с соплом, рассчитанную на центрифугирование в микроцентрифуге при 10 000g, и предназначено для элюции ДНК из образующихся в этом процессе мельчайших кусочков агарозного или полиакриламидного гелей. Причем данная процедура требует всего около 10 мин. Также весьма быстрая очистка ПЦР-продуктов, завершаемая всего за 7-20 мин, возможна с помощью хроматографии высокого давления [Katz, Dong, 1990; Kalnoski et al., Warren, Doninger, 1991], что, однако, требует наличия специального дорогостоящего оборудования.

В то же время в литературе встречаются сообщения об успешном секвенировании ПЦР-продуктов без какой-либо их очистки [Meltzer et al., 1990; Srivastava et al., 1992; Douglas et al., 1993; Liu et al., 1993]. Непременным условием этого является, как уже отмечалось выше, наличие единственного целевого продукта и отсутствие гетерогенных амплификатов. Другим условием является использование в ПЦР относительно низких концентраций в реакционной смеси как дНТФ, так и олигонуклеотидных праймеров. Так, в качестве примера можно привести работу, в которой в первую фазу (30 циклов) осуществлялась амплификация фрагмента ДНК с помощью ДНК-полимеразы Thermus flavus в присутствии всего 10 мкМ каждого из дНТФ, а во вторую фазу, после добавления меченого праймера (одного из амплификационных) и соответствующих количеств ддНТФ уже проводились терминирующие реакции [Rao, Saunders, 1992]. В другой работе в качестве фермента использовалась ДНК-пол имераза Deep VentR®(exo-) из архебактерии Pyrococcus sp., способная к эффективному построению цепей ДНК при достаточно низких концентрациях дНТФ, что также не потребовало удаления невключившихся ингредиентов из первой реакции [Манате, 1996].

Хорошо известно, что гораздо лучшие результаты дает секвенирование одноцепочечной ДНК, которая не содержит в реакционной смеси комплементарной цепи. Существует много подходов к достижению этой цели как на этапе самой ПЦР, так и после ее завершения. Самым простым вариантом можно считать подход, заключающийся в проведении второй стадии ПЦР уже только с одним праймером с небольшой аликвотой, взятой из первой реакции [Kaltenboeck et al., 1992]. Хотя необходимо отметить, что вместе с ДНК-продуктом в этом случае перенесется и второй праймер, который будет присутствовать хотя и в меньшей концентрации, но все же будет принимать участие в амплификации, приводя к образованию и второй цепи ДНК. Таким образом, можно считать, что амплификация проводится с двумя праймерами, имеющими разную концентрацию, что и было реализовано в виде асимметричной ПЦР, описанной ниже. Так, достаточно простой способ наработки одной из цепей фрагмента ДНК состоит в асимметричной амплификации, которая становится возможной из-за значительной разницы (в 50-100 раз) в количестве присутствующих в реакционной смеси двух праймеров [Gyllensten, Erlich, 1988; Innis et al., 1988; Wilson et al., 1990]. В результате во время ПЦР происходит истощение первого праймера (представленного в низкой концентрации), что приводит к накоплению в последующих циклах одноцепочечных продуктов удлинения второго праймера (рис.). Серьезными недостатками этого подхода являются неоптимальные условия амплификации, заметно снижающие выход целевого продукта, и необходимость в отдельных случаях экспериментальным путем подбирать оптимальное количественное соотношение этих двух праймеров.

Подобный эффект достижим и при использовании двух праймеров, имеющих сильно отличающуюся температуру отжига. Этот процесс, названный авторами [Mazars et al., 1991] "температурной асимметричной ПЦР", заключается в проведении первых 25 циклов при низкой температуре отжига, характерной для одного из праймеров и приемлемой одновременно и для второго, и уже затем следует проведение дальнейших циклов при более высокой температуре, соответствующей температуре отжига второго праймера, что не позволяет, таким образом, отжечься первому (рис.). Результатом этого будет накопление в этих циклах второго этапа только одной цепи ДНК, представляющей собой продукт ферментативного удлинения второго праймера.

Своеобразный способ "удаления" из реакции одной из цепей ДНК, полученной в ходе ПЦР, осуществляется путем ее гибридизации с клонированным ранее в соответствующей ориентации подобным (гомологичным) фрагментом в одноцепочечном векторе М13 [Gal, Hohn, 1990; Gal, 1993, 1996]. Причем клонированный фрагмент не должен содержать места отжига амплификационных и секвенирующего праймеров, чтобы не вызывать конкуренцию. В цитируемой работе показано улучшение качества картины секвенируемых полос ДНК после добавления в реакционную среду возрастающих количеств одноцепочечной ДНК вектора М13, несущего вставку, что объясняется одновременным увеличением доступного для ДНК-полимеразы числа копий нужной цепи секвенируемого ПЦР-фрагмента. Однако подобный подход применим только в специальных случаях секвенирования новых членов какого-либо семейства повторяющейся ДНК или гомологичных генов других организмов, поскольку предполагает наличие заранее клонированного участка такого фрагмента ДНК.

Интересен способ получения из двуцепочечного ПЦР-продукта одноцепочечной матрицы, пригодной для ее секвенирования обратной транскриптазой [Stoflet et al., 1988]. Особенностью этого метода является то, что матрица представляет собой РНК-копию ПЦР-фрагмента ДНК. Такое становится возможным благодаря специальному праймеру (одному из пары амплификационных), несущему, кроме комплементарной последовательности к секвенируемому фрагменту ДНК, участок промотора фагов Т7, или ТЗ, или SP6 [Lind et al., 1996]. Таким образом, после завершения самой ПЦР в реакционную смесь добавляется фермент Т7 РНК-полимераза, способная за короткий промежуток времени наработать значительное число молекул РНК, представляющих собой, в данном случае, матрицы для секвенирования (рис. 3.4).

Другой ферментативный подход к созданию одноцепочечной матрицы заключается не в построении, а наоборот, в удалении одной из цепей ДНК (рис.). Известно, что экзонуклеаза фага лямбда разрушает цепь ДНК в направлении 5' → 3', однако для проявления этой ее активности 5'-конец цепи ДНК должен нести остаток фосфорной кислоты. Так, использование во время амплификации фосфорилированного праймера (одного из пары) позволило затем с помощью экзонуклеазы фага лямбда удалить эту фосфорилированную цепь ПЦР-фрагмента ДНК [Higuchi, Ochman, 1989; Takagi et al., 1993; Berg, Olaisen, 1994].

Удаление одной цепи ПЦР-продукта с помощью экзонуклеазы III [Ward et al., 1989] основано на факте возможной защиты другой цепи тиопроизводным дНТФ, которое данный фермент "не узнает" [Putney et al., 1981]. Такая защита одной цепи ПЦР-продукта достигалась путем его расщепления какой-либо подходящей рестрикционной эндонуклеазой и последующим ферментативным действием Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы в присутствии трех обычных дНТФ и одного тио-дАТФ. Однако необходимо отметить, что данный способ применим далеко не всегда и, главным образом, из-за ограничений, вызванных самой нуклеотидной последовательностью амплифицируемого фрагмента ДНК. В другой работе сообщается об использовании для удаления одной из цепей фрагмента ДНК экзонуклеазы, кодируемой геном 6 фага Т7 и успешном проведении затем ПЦР-секвенировании [Somers et al., 1998].

Один из предложенных способов отделения одной цепи от другой для ПЦР-наработанных фрагментов ДНК, получивший в дальнейшем серьезное развитие, заключался в аффинной хроматографии полученных продуктов на колонке со стрептавидин-агарозой [Mitchell, Merril, 1989]. Такое становилось возможным благодаря использованию при амплификации ДНК биотинилированного праймера, поскольку в результате дальнейшей элюции с такой колонки с использованием 0,2 N NaOH как элюента происходила денатурация ДНК и выход биотиннесо-держащей цепи ДНК. Что касается биотинилированной цепи ДНК, то она в этом случае оказывалась прочно связанной со стрептавидином и оставалась в колонке. Таким образом, из двух цепей ДНК только одна оказывалась доступной для секвенирования и "виновата" в этом была так называемая твердая фаза в виде не совсем удобной стрептавидин-агарозы.