Секвенирование пцр-фрагментов

Определение "Секвенирование пцр-фрагментов" в ЭБНБ

Одной из первых опубликованных работ, где было осуществлено секвенирование двух клонированных в векторе М13 фрагментов ДНК, полученных путем амплификации с использованием Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I в качестве фермента, была статья Шарфа и соавт [Scharf et al., 1986]. Чтобы упростить процедуру лигирования, последовательности праймеров, используемые в их работе, несли в своей 5'-области сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, но, несмотря на это, эффективность клонирования составила только 1%. Далее полученные клоны секвенировали обычным дидезокси-методом.

Использование в ПЦР термостабильной ДНК полимеразы из бактерии Thermus aquaticus значительно упростило саму процедуру амплификации, поскольку отпала необходимость добавления новых порций фермента после этапов температурной денатурации, однако при этом появились другие проблемы. Одна из таких проблем заключалась в нематричном синтезе, осуществляемом Taq ДНК-полимеразой, и приводящем к образованию цепей ДНК с дополнительным выступающим нуклеотидом на 3'-конце, в большинстве случаев являющимся аденином [Clark, 1988; Ни, 1993]. Из-за этого дополнительного нуклеотида, присутствующего в подавляющем числе амплифицированных фрагментов ДНК, их лигирование с подготовленным вектором, имеющим тупые концы, протекает крайне плохо, что приводит к низкой эффективности клонирования амплификатов. Какие только ухищрения не предпринимаются исследователями, чтобы как-то обойти эту проблему! Используют праймеры с дополнительными участками, несущими сайты узнавания подходящих рестрикционных эндонуклеаз, обрабатывают концы амплификатов различными ферментами, готовят специальные вектора, осуществляют соединение вставки и вектора путем отжига их концов и пр.

Одним из активно используемых в настоящее время подходов является применение специальных, так называемых Т-векторов, предварительно расщепленных какой-либо рестрикционной эндонуклеазой и несущих выступающие тимидины на своих 3' -концах, что достигается различными способами [Holton, Graham, 1991; Kovalic et al., 1991; Marchuket al., 1991; Cease, Lohff, 1993; Cha et al., 1993; Ichihara, Kurosawa, 1993; Harrison et al., 1994; Iwahana et al., 1994]. В то же время сообщается и об успешном клонировании амплифицированных фрагментов ДНК в векторе с тупыми концами за счет присутствия среди ПЦР-продуктов и таких, у которых не имеется дополнительного нематричного нуклеотида на 3'-конце [Haqqi, 1992]. Другим решением проблемы клонирования амплификатов является "полирование" их концов с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I, T4 ДНК-полимеразы или использование в ПЦР термостабильных ДНК-полимераз, обладающих 3' → 5'-экзонуклеазной редактирующей активностью, приводящих к получению фрагментов ДНК с тупыми концами без дополнительных нематричных нуклеотидов [Lundberg et al., 1991; Mattila et al., 1991; Lohff, Cease, 1992].

Еще одна проблема заключается в том, что Taq ДНК-полимераза, как, впрочем, и другие ДНК-полимеразы, иногда включает "неверные" некомплементарные нуклеотиды, но ввиду отсутствия у нее 3' → 5'-экзонуклеазной редактирующей активности, они остаются в новосинтезированной цепи ДНК. Считается, что частота таких "ошибок" Taq ДНК-полимеразы достаточно высока и зависит от ряда факторов. К некоторым из них можно отнести или очень высокую концентрацию всех четырех дНТФ, или "истощение" какого-нибудь одного из трифосфатов, или очень низкую их концентрацию. Поскольку при клонировании в векторную молекулу встраивается только одна копия, то теоретически она может нести измененные нуклеотиды. Вероятность этого значительно повышается в случае, если Taq ДНК-полимераза допустила "ошибку" в ранних циклах ПЦР и соответственно тем большее число амплифицированных молекул будет нести такие измененные нуклеотиды. Таким образом, определение нуклеотидной последовательности одного такого клона не гарантирует достоверности полученных результатов. В какой-то степени проблема может быть решена секвенированием нескольких независимых клонов и лучше с клонированными амплификационными фрагментами из разных ПЦР, поскольку вероятность ошибочного включения дНМФ в одно и то же место матрицы ДНК невелика. Еще одно нежелательное явление в виде рекомбинации ДНК в ходе ПЦР, происходящей с частотой около 5% [Meyerhans et al., 1990; Odelberg, et al., 1995], также может быть преодолено секвенированием разных клонов [Paabo, Wilson, 1988]. Однако нельзя исключить определенный полиморфизм участков ДНК, особенно принадлежащих к повторяющимся элементам генома, вследствие чего выявляемые отличия между разными клонами могут быть, и не обязательно, результатом ошибок Taq ДНК-полимеразы. В то же время в литературе имеются сообщения о довольно высоком качестве построения новой комплементарной цепи ДНК Taq ДНК-полимеразой в оптимальных условиях [Eckert, Kunkel, 1990]. Так, в цитируемой работе авторы приводят доказательства, что и замена нуклеотидов, и сдвиг рамки считывания в ходе ПЦР происходят реже, чем 1 событие на 100000 нуклеотидов.

Непосредственно сама техника секвенирования клонированных амплификатов ничем не отличается от таковой для прочих клонированных фрагментов ДНК и подробно описана в предыдущей главе. В этой связи более не будем задерживаться на секвенировании клонированных фрагментов ДНК, полученных с помощью ПЦР, и перейдем к рассмотрению ПЦР-секвенирования ДНК, не предусматривающему клонирование.