Пцр-секвенирование днк

Определение "Пцр-секвенирование днк" в ЭБНБ

Амплификация фрагмента ДНК

Открытие возможности избирательной амплификации определенных участков ДНК с помощью полимеразной цепной реакции [Saiki et al., 1985, 1988] оказало чрезвычайно сильное влияние на всю молекулярную биологию, включая и секвенирование ДНК. До появления этого метода можно было секвенировать только рекомбинантные молекулы ДНК (кроме некоторых частных случаев). Причина этого кроется в низком содержании в геноме какой-либо определенной, даже повторяющейся, последовательности и невозможности детекции столь малого количества фрагментов ДНК при их секвенировании. Теоретически можно было бы детектировать на радиоавтографе секвенирующего геля полосы ДНК какого-нибудь условного гена, если взять в реакцию около 500 мг тотальной ДНК с ее концентрацией в реакционной смеси приблизительно 50 г/мл. Поскольку такое принципиально невозможно, то для определения последовательности нуклеотидов было необходимо использовать ДНК, "обогащенную" каким-либо геном или просто определенным участком, что и достигалось ранее посредством клонирования. В связи с достаточной сложностью методов клонирования получение таких рекомбинантных ДНК и их последующее секвенирование было доступно далеко не всем не молекулярно-биологическим лабораториям. Амплификация же определенных фрагментов ДНК с помощью специфических праймеров, приводящая за короткий промежуток времени к наработке значительных количеств нужных участков ДНК, явилась мощной и доступной альтернативой методу клонирования. Таким образом, многие лаборатории, ранее и не помышлявшие о секвенировании ДНК ввиду сложности подготовительных этапов, стали активно использовать этот метод в своих исследованиях. Поэтому можно смело предположить, что удельный вес ПЦР-секвенирования в общем определении нуклеотидных последовательностей различных ДНК будет несомненно возрастать. Что касается тех, кто и так раньше владел методами секвенирования ДНК, то они также взяли на вооружение метод ПЦР-секвенирования и занялись разработкой его различных модификаций, рассмотрению которых и будет посвящена данная глава.

Но прежде чем перейти к подробному изложению, стоит еще немного задержаться на том "что же, собственно, подразумевается под ПЦР-секвенированием ДНК?". Так, в большинстве случаев метод ПЦР просто служит для получения в требуемых количествах определенного участка ДНК, намечаемого к секвенированию, что в некоторой степени заменяет молекулярное клонирование или субклонирование этих же фрагментов ДНК. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК непосредственно в ходе ПЦР в присутствии дидезокситерминаторов носит название "циклического секвенирования" и имеет свои особенности. Иногда трудно провести грань между этими подходами, поскольку в циклическом секвенировании часто на первой стадии имеет место именно наработка материала для его дальнейшего секвенирования.

Несмотря на то, что ПЦР посвящено огромное количество статей, обзоров и целых книг (многие из которых приведены в данной главе как литература для дополнительного чтения), все же позволим себе очень кратко остановиться на самом принципе полимеразной цепной реакции, приводящей за короткий промежуток времени (от 10 мин до нескольких часов, что зависит от типа применяемого ДНК амплификатора, условий и задач эксперимента) к наработке значительных количеств целевого фрагмента ДНК.

Основными компонентами полимеразной цепной реакции, в ходе которой амплифицируется определенный участок молекулы ДНК, являются, во-первых, сама исходная ДНК, во-вторых, олигонуклеотидные праймеры, ограничивающие выбранный участок ДНК, фермент ДНК-полимераза и "строительный материал" в виде смеси дНТФ. Дополнительные требования, предъявляемые к этим компонентам, заключаются в следующем. Исходная ДНК должна нести в своем составе тот участок, который намечено амплифицировать. Олигонуклеотидные праймеры из подобранной пары должны быть комплементарны противоположным цепям ДНК и при этом ограничивать выбранный участок так, что при их ферментативном удлинении вновь синтезируемые цепи ДНК будут расти навстречу друг другу. Из этого следует, что для выбора и синтеза самих олигонуклеотидных праймеров исследователю должна быть известна какая-то часть последовательности ДНК в выбранных регионах. (Отдельные случаи использования в качестве затравочных молекул праймеров с произвольной выбранной последовательностью нуклеотидов здесь не рассматриваются.) Кроме этого, на праймеры накладывается масса других ограничений с целью исключения их нежелательной интра- и интергомологии, формирования вторичной структуры, при этом необходимо учесть также температуры отжига каждого из них на матрице ДНК. Все это достаточно детально рассмотрено в рекомендуемых книгах и статьях [Rychlik, Rhoads, 1989; Lowe et al., 1990; Kwok et al., 1994; Rychlik, 1995], и в связи с этим нет особого смысла останавливаться на этом подробнее. Более того, существует множество специальных компьютерных программ, позволяющих выбрать наиболее оптимально подходящие праймеры для каждого эксперимента. Что касается фермента ДНК-полимеразы, то, несмотря на то, что в первых опытах по амплификации ДНК это был простой Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I и его использование для этой цели принципиально возможно и сейчас, в настоящее время необходимо применять какие-либо термостабильные ДНК-полимеразы, выдерживающие высокую температуру (95° С или около того) в течение значительного промежутка времени.

Периодический нагрев реакционной смеси до столь высокой температуры вызван циклическим характером протекания реакции амплификации ДНК и предназначен для денатурации цепей ДНК (как исходных, так и вновь синтезированных). Во время следующего этапа каждого цикла, проводимого обычно при температуре около 50°-60° С, происходит отжиг олигонуклеотидных праймеров на одно-цепочечной ДНК. Далее следует повышение температуры до оптимальной для используемой термостабильной ДНК-полимеразы (обычно 72° -75° С), во время чего осуществляется ферментативное удлинение праймеров и построение таким образом новых комплементарных цепей ДНК. Цикл завершается. Для возобновления процесса и начала нового цикла опять необходимо наличие в реакционной смеси одноцепочечных молекул ДНК, что достигается кратковременным повышением температуры до тех же 95° С. После отжига праймеров на денатурированной одноцепочечной ДНК эти вновь образовавшиеся комплексы служат для фермента матрицами с затравкой. Цепной же данная реакция названа потому, что продукты, наработанные ДНК-полимеразой в ходе предыдущего(их) цикла(ов), используются в последующем(их) цикле(ах).

Процесс накопления продуктов в ходе ПЦР достаточно сложен, чтобы быть выраженным какой-нибудь простой (относительно, конечно) математической формулой. Так, кроме начавшейся с третьего цикла, амплификации целевых фрагментов ДНК, ограниченных с обеих сторон праймерами, с каждым новым циклом в цепную реакцию вовлекаются вновь синтезированные по гетерогенным матрицам подобные ампликоны. При этом одновременно продолжается увеличение числа самих гетерогенных матриц, комплементарных цепям исходного фрагмента ДНК. Как можно видеть из упрощенной (поскольку приведены нарабатывающиеся ПЦР-продукты только для одной из двух исходных цепей ДНК, обозначенной здесь прямой линией - впрочем, для комплементарной цепи, обозначенной волнистой линией, эта схема полностью справедлива) схемы протекания ПЦР, изображенной на рис., в первом цикле образуются только гетерогенные по размеру цепи ДНК (продукт А), так как их терминация будет происходить произвольно. Только во втором цикле в реакционной смеси появляются целевые фрагменты ДНК, причем комплементарные цепи этого фрагмента (А1) на этом этапе спарены с гетерогенными матрицами и для большей наглядности расположены в нижней части схемы. В верхней части схемы, для которой на данном рисунке некой "демаркационной" линией служит одна из цепей исходного фрагмента ДНК, продолжающая также служить матрицей и в последующих циклах, изображены целевые фрагменты определенного размера, ограниченные по краям праймерами. Дальнейшее накопление таких фрагментов (А1,А2,АЗ,А4..., В1,В2... и т.д.) происходит экспоненциально, тогда как первый тип гетерогенных молекул (А, В, С, D, Е и т.д.) будет накапливаться только в арифметической прогрессии. Таким образом, например, после 25 циклов такие гетерогенные молекулы будут составлять ничтожную часть, которой, в подавляющем большинстве случаев, можно просто пренебречь.