Ферментативное секвенирование днк

Определение "Ферментативное секвенирование днк" в ЭБНБ

Борпроизводное дНТФ

В середине 1980-х годов возник метод ферментативного секвенирования ДНК без использования уже привычных дидезоксинуклеотидов в качестве терминаторов строящейся цепи ДНК [Labeit et al., 1986; Labeit et al., 1987]. Более того, никакой заданной терминации растущей цепи ДНК на этапе ее построения даже не требовалось. Вместо дидезоксипроизводных использовались дНТФαS, у которых в остатке фосфорной кислоты в α-положении один из кислородов был замещен на атом серы. Данные соединения не останавливали синтез цепи ДНК, а служили в качестве своеобразных ограничителей для фермента экзонуклеазы III, с помощью которой и осуществлялась специфическая деградация секвенируемых фрагментов ДНК, несущих радиоактивную метку на одном из концов, благодаря использованию праймера с 32Р на 5'-конце. Как известно, экзонуклеаза III последовательно удаляет нуклеотиды с 3'-конца цепи ДНК, но, как было выяснено, не способна к узнаванию и соответственно удалению тиопроизводных нуклеотидов [Putney et al., 1981]. Основываясь на этом факте, были составлены реакционные А-, С-, G- и Т-смеси, в которых наряду с обычными присутствовали и их соответствующие для каждой реакции тиопроизводные, что приводило к их произвольному включению в процессе построения новой цепи ДНК. После завершения полимеразной реакции проводилась обработка экзонуклеазой III, и конечные продукты разделялись обычным секвенирующим гель-электрофорезом с последующей радиоавтографией. Однако предел "чтения" секвенируемых данным подходом фрагмента ДНК был невелик и отчасти из-за того, что экзонуклеаза III, обладая разным сродством к различным нуклеотидам [Linxweiler, Horz, 1982], все же расщепляла тиопроизводные цитозина.

Определение нуклеотидной последовательности ДНК

Некий гибрид методов химической деградации и ферментативного определения нуклеотидной последовательности ДНК был положен в основу подхода к секвенированию ДНК с теми же тиопроизводными [Gish, Eckstein, 1988; Nakamayae et al., 1988]. Отличия от описанного выше подхода с экзонуклеазой III заключались, во-первых, в том, что реакционные смеси содержали только три обычных дНТФ и по одному тио-дНТФ, и, во-вторых, химическая фрагментация цепей ДНК проводилась посредством алкилирующего агента, которым обычно служили 2-йодоэтанол или 2,3-эпокси-1-пропанол, причем последний, характеризуясь большей реакционной способностью для проведения реакции, требовался в меньшем количестве. Поскольку в каждой реакционной смеси один из четырех дНТФ был представлен только своим тиопроизводным, то, следовательно, все нуклеотиды данного типа в синтезированной цепи ДНК несли атом серы в остатке фосфорной кислоты. Посредством ограниченного гидролиза алкилирующим агентом более лабильных тиофосфатных диэфиров происходило их расщепление и радиоактивно меченные продукты реакции разделялись секвенирующим гель-электрофорезом.

Здесь, по-видимому, нельзя не отметить тот факт, что в основе уже упоминавшегося в самом начале этой главы метода секвенирования ДНК путем рибозамещения [Barnes, 1978] лежит схожий принцип не терминации растущей цепи ДНК, а ее полного построения с происходящим произвольным включением соответствующих рибонуклеотидов, выступающих в роли своеобразных ограничителей. Поскольку реакционные смеси при проведении основного этапа содержали все 4 дНТФ и по одному рибоНТФ (в каждой пробирке - своего и в определенном соотношении к аналогичному дезоксипроизводному), то это приводило к образованию комплементарной полинуклеотидной цепи ДНК, в которой статистически случайно были представлены и рибопроизводные. Далее следовал этап расщепления новосинтезированной цепи ДНК по таким рибонуклеотидам с помощью или щелочи, или неспецифической РНКазы. Разделение продуктов реакции секвенирующим гель-электрофорезом позволяло определять последовательность нуклеотидов исследуемого фрагмента ДНК.

Следующим этапом развития определения нуклеотидной последовательности ДНК с тиопроизводными, как ограничителями расщепления ДНК, явился способ секвенирования путем амплификации определенного фрагмента Taq ДНК-полимеразой в присутствии двух олигону-клеотидных праймеров, один из которых нес 32Р метку на 5'-конце, и четырех дНТФ, один из которых также присутствовал и в качестве ограничителя в виде тиопроизводного, что позволило потом провести расщепление новой цепи ДНК фосфодиэстеразой змеиного яда [Olsen, Eckstein, 1989]. В этой работе авторы подбирали условия амплификации таким образом, чтобы Taq ДНК-полимераза успевала включать тиопроизводные и обеспечивала дальнейший рост цепи и соответственно амплификацию фрагмента ДНК, протяженность которого составляла немногим менее 1 тпн. Однако следует отметить, что какого-либо значительного увеличения производительности секвенирования ДНК этим методом авторам добиться не удалось.

Новое развитие метод секвенирования ДНК с ограничителями получил после создания нового класса нуклеотидных аналогов, так называемых 2'-дезоксинуклеотид-5'-α-Р-борано]-трифосфатов (рис.), в которых один из атомов кислорода у а-остатка фосфорной кислоты замещен борпроизводным [Sood et al., 1990].

К важным чертам борпроизводных нуклеотидов следует отнести их термостабильность, что позволяет использовать их в ПЦР, а также их нераспознавание экзонуклеазои Ш [Li et al., 1995]. Последнее легло в основу разработанного подхода к секвенированию ДНК при помощи ПЦР и данных борпроизводных нуклеотидов [Porter et al., 1997].

Как можно видеть из принципиальной схемы данного подхода определения нуклеотидной последовательности, приведенной на рис. 2.27, в ходе осуществления секвенирования ДНК происходит отжиг двух праймеров, один из которых является меченым. (В цитируемой работе праймер был флуоресцентно меченным и для большего удобства при переходе от одной реакции к другой авторы ввели в этот праймер и биотиновую метку.) Затем происходит амплификация фрагмента ДНК, ограниченного данными праймерами, посредством специфических А-, С-, G- и Т-реакций в присутствии четырех обычных дНТФ и одного соответствующего борпроизводного, представленного в меньшей концентрации. В результате проведения ПЦР конечные продукты данных реакций будут нести полноразмерные фрагменты ДНК, в которые произвольным образом оказались встроенными борпроизводные нуклеотидов. На данном этапе было осуществлено удаление всех ставших уже ненужными реакционных компонентов путем связывания биотинилированного ПЦР продукта (за счет исходного биотинилированного праймера) с магнитными частицами, покрытыми стрептавидином. После необходимой промывки и суспендирования в экзонуклеазном буфере продукты реакций были подвергнуты расщеплению экзонуклеазой III и фосфодиэстеразой I и после денатурации нанесены на секвенирующий гель. Полученные результаты сравнительного секвенирования в двух автоматических секвесторах (один цвет, четыре дорожки и четыре цвета, одна дорожка) с обычными дидезокситерминаторами и с борпроизводными показали высокое качество последнего.