Терминирующие реакции по методу сэнгера

Определение "Терминирующие реакции по методу сэнгера" в ЭБНБ

Пожалуй, ключевым моментом ферментативного метода секвенирования ДНК, разработанного Сэнгером и соавт. [Sanger et al., 1977], является образование специфически терминированных меченых фрагментов вновь синтезированной ДНК. Такая терминация построения комплементарной цепи ДНК происходит при включении ДНК-полимеразой в растущую цепь ДНК-модифицированных аналогов природных субстратов, не допускающих присоединения дальнейших нуклеотидов. Наиболее широко применяемыми среди таких модифицированных аналогов являются 2',3'-дидезоксинуклеотид-5'-трифосфаты, характеризующиеся отсутствием второго гидроксильного остатка в 3'-положении рибозного кольца и превращению ее, таким образом, в дидезоксирибозу и невозможностью поэтому образовывать фосфодиэфирные связи между нуклеотидами в цепочке ДНК. В оригинальной статье Сэнгера и соавт., наряду с ддНТФ, для терминации цепи также был применен ара-бинодезоксицитозинтрифосфат [Sanger et al., 1977a], однако широкого применения арабинопроизводные не получили. Надо заметить, что механизм ингибирования дальнейшего роста цепи ДНК путем включения арабинопроизводных не совсем ясен [Davies, 1982]. Предполагается, что ДНК-полимераза (Кленовский фрагмент) имеет низкую аффинность к 3'-гидроксилу β-D-арабинофуранозильного сахара.

Как уже отмечалось выше, используемые в секвенировании ДНК ДНК-полимеразы обладают разным сродством к дидезоксипроизводным и соответственно различной скоростью включения последних в растущую цепь ДНК. Таким образом, для эффективного построения цепи ДНК в условиях терминации необходимо использовать определенные, для каждого фермента свои, соотношения дНТФ и ддНТФ.

Как можно видеть из приведенных в табл. данных, Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I обладает заметной дискриминацией в отношении ддНТФ, причем эффективность включения каждого из них в свою очередь также разнится. Последнее, впрочем, вполне объяснимо, поскольку известно, что во взаимодействие с тем или иным дНТФ вступают разные аминокислоты активного центра Кленовского фрагмента [Astatke et al., 1995] и для их ддНТФ-аналогов скорее всего мало что меняется. В связи с этим соотношение различных ддНТФ/дНТФ в реакционной смеси достаточно уникально и в оригинальных статьях встречаются иногда еще более дробные величины. То же самое отчасти справедливо и для AMV-ревертазы, Bst ДНК-полимеразы и Taq ДНК-полимеразы.

Что касается секвеназы, то в табл. для нее приведены базовые соотношения дНТФ/ддНТФ (10:1), рассчитанные на эффективное построение в условиях терминации цепи ДНК довольно малой протяженности. Таким образом, при указанных соотношениях дНТФ/ддНТФ наибольшее число терминированных фрагментов окажется в диапазоне 50-500 нуклеотидов (при этом концентрации дНТФ на этапе мечения также должны быть соответствующими). Однако, учитывая высокую процессивность этого фермента, возможен сдвиг наибольшей представленности терминированных фрагментов в область более крупных молекул ДНК. Например, такое соотношение дНТФ/ддНТФ как 30:1 позволит получать специфически терминированные фрагменты ДНК длиной до 2000 нуклеотидов. Замена в реакционном буфере ионов Mg²⁺ на ионы Mn²⁺ повышает эффективность включения в растущую цепь ДНК ддНМФ и, таким образом, сдвигает область фрагментов ДНК превалирующих размеров [Tabor, Richardson, 1989a]. Особая актуальность такой замены ионов в реакционной смеси отмечается в случаях ограниченного количества матрицы ДНК.

Концентрации дНТФ и соответствующих ддНТФ в терминирующих реакционных смесях для некоторых ДНК-полимераз, применяемых в секвенировании ДНК

При использовании для проведения реакций мечения и терминирования высокопроцессивной секвеназы, обладающей к тому же высокой скоростью полимеризации, необходимо ограничивать время протекания этих реакций по двум причинам. Поскольку на стадии мечения дНТФ присутствуют в низких концентрациях при чрезмерно продолжительной инкубации (свыше 5 мин) секвеназа может удлинить праймер настолько, что при этом начнут истощаться содержащиеся в растворе дНТФ. Следствием может быть неспецифическое терминирование новосинтезируемых цепей ДНК и при условии невозобновления их дальнейшего синтеза на стадии терминации увеличенный фон при радиоавтографии. Вторая причина заключается в отрицательном вкладе пирофосфоролиза, который становится заметен при продолжительной инкубации и истощении нуклеотидтрифосфатов в реакционной смеси.

Известно, что отдельные участки молекул ДНК иногда не удается "прочесть" обычным способом из-за того, что на заключительном радиоавтографе наблюдаются полосы в двух-трех или сразу во всех четырех соседних дорожках. Причин тому бывает несколько. Считается, что одной из легко устраняемых причин может быть недостаточная степень очистки матрицы ДНК, предполагаемой к секвенированию. В этом случае рекомендуется провести дополнительные этапы депротеинизации и/или переосаждение этанолом. Другая причина может заключаться в формировании в этом месте ДНК участка с сильной вторичной структурой и образовании структур, подобных "шпилькам", что наиболее характерно для молекул ДНК с высоким GC-составом. ДНК-полимераза не может эффективно осуществлять синтез комплементарной цепи в этих местах, в связи с чем образуются неспецифически терминированные фрагменты ДНК. Преодолеть это иногда можно простым повышением температуры инкубации при проведении терминирующих реакций. Так, Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I при 42°С или даже 55°С или секвеназа при 45°С бывают способны преодолеть это препятствие за счет того, что при такой повышенной температуре участок вторичной структуры может уже "расплестись". Другая возможность заключается в добавлении в реакционную смесь диметилсульфоксида [Seto, 1990; Seto et al., 1995] или формамида [Zhang et al., 1991], способствующих понижению температуры плавления участков со вторичной структурой. Правда, было показано, что присутствие в реакционной смеси даже 30% формамида (добавляемого из расчета 0,7% формамида на каждый 1% GC-пар, превышающий их 50%-ное содержание, взятое за отправную точку) не способно ликвидировать отдельные "стопы", причем на фоне уже более слабых из-за формамида сигналов, принадлежащих остальной последовательности ДНК [Zhang et al., 1991]. Были рекомендации уменьшить в реакционной смеси концентрацию NaCl, что дестабилизирует потенциальную вторичную структуру фрагментов ДНК [Ornstein, Kashdan, 1985]. Однако в случае "шпильки", обогащенной GC-парами, такие ухищрения могут не привести к желаемому результату. Тогда необходимо использовать термостабильные ДНК-полимеразы (Bst, Taq или аналогичные), оптимум температуры которых составляет 65°, 72°С или даже несколько выше [Innis et al., 1988; McClary et al., 1991; Ranu, 1994]. При таких температурах участки со вторичной структурой обычно перестают существовать и ДНК-полимеразы беспрепятственно их "проходят".

В литературе встречаются рекомендации последовательного использования двух ДНК-полимераз, одна из которых, как правило, термостабильна. В целом ряде статей сообщается об успешном последовательном применении секвеназы и Taq ДНК-полимеразы при оптимальных температурах инкубации для каждого фермента при секвенировании GC-богатых ДНК [Khambaty, Ely, 1990; Beck et al., 1993; Austin, 1995]. Одновременное использование двух не термостабильных ДНК-полимераз - Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I и секвеназы -позволило исключить характерные для секвенируемой матрицы "стопы" [Redston, Kern, 1994]. Независимое секвенирование одной и той же матрицы разными полимеразами (Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы I и обратной транскриптазой) и их последующее одновременное разделение гель-электрофорезом позволило "прочитать" отдельные " трудные" участки ДНК, поскольку эти полимеразы формировали "стопы" в несколько отличающихся местах [Ornstein, Kashdan, 1985].

Осуществление "чейз"-реакции после построения комплементарной цепи ДНК Т7 ДНК-полимеразой с помощью высоких концентраций дНТФ и терминальной нуклеотидтрансферазы, являющейся кематричной ДНК-полимеразой, позволило исключить образовавшиеся "стопы" [Fawcett, Bartlett, 1990; Kho, Zarbl, 1992]. Ранее подобный эффект был получен при секвенировании молекул РНК с помощью ревертазы с последующим "чейзом" с терминальной нуклеотидтрансферазой [DeBorde et al., 1986]. Терминальная нуклеотидтрансфераза присоединяет значительное количество нуклеотидов к свободному 3'-ОН-концу, не содержащему ддНМФ, и в результате образуются фрагменты весьма крупного размера, при электрофоретическом разделении остающиеся в самой верхней части геля. Однако другие авторы указывают на инверсию отдельных нуклеотидов, выделенных (подчеркнуто) в участке ACGCCGGCA. приведшую, как они считают, в результате действия терминальной нуклеотидтрансферазы к последовательности ACCGCGCGA. причем картина секвенируемых полос не вызывала каких-либо серьезных подозрений [Simard, Langlois, 1995]. Впрочем, весьма трудно представить, что же реально произошло в данном случае с фрагментом ДНК под действием терминальной трансферазы. В то же время внимательное рассмотрение указанных нуклеотидных последовательностей позволяет предположить, что произошли следующие события. Так, при секвенировании этого участка ACGCCGGCA, скорее всего, имеет место двойная компрессия полос (хотя авторы при проведении терминирующих реакций использовали 7-деаза дГТФ, способствующий недопущению компрессии) и он стал виден на радиоавтографе как ACCGCGCGA. Следует отметить, что ранее подобный эффект (инверсии GC в CG, правда, без участия терминальной нуклеотидтрансферазы) был отмечен и в другой работе [Odagiri, 1994]. Здесь автор решил, что инверсия этих нуклеотидов (GC следующих за последовательностью GAAA в CG) в участке AGCGAAAGCAAGG образуется за счет того, что GAAA служит неким сигналом для фермента секвеназы для "неправильного" включения этих нуклеотидов при построении ею комплементарной цепи. В то же время похожий участок AGCAAAAGCAGG в этой же работе "читался" правильно. Можно предположить, что причиной такой инверсии нуклеотидов также является компрессия, несмотря на то, что при проведении терминирующих реакций автор использовал дИТФ, способный в большинстве случаев ликвидировать это явление.

Другим способом преодоления ДНК-полимеразами возникающих "шпилек" считается подход с использованием специфических белков, связывающихся с одноцепочечной ДНК и ликвидирующих вторичную структуру матриц ДНК. Присутствие в реакционной смеси специфического SSB-белка Е. coli заметно улучшает эффективность построения комплементарной цепи ДНК и исключает образование "стопов". Также было показано, что проведение терминирующих реакций с двуцепочечной матрицей посредством секвеназы в присутствии другого связывающегося с одноцепочечной ДНК белка, кодируемого геном 32 фага Т4, значительно улучшало картину полос секвенируемой ДНК на заключительном радиоавтографе [Kaspar et al., 1989]. Однако главное неудобство применения таких специфических к однонитевой ДНК белков заключается в необходимости их обязательного удаления перед нанесением продуктов терминирующих реакций на полиакриламидный гель. Предложены различные, подчас весьма сложные способы их удаления, включая обработку протеиназой К. Быстрый метод удаления таких белков основан на использовании очень сильного катионообменника 50W-X2 (Bio-Rad, США), или специальной смолы Wizard фирмы "Promega" (США) [Kaczorowski, Szybalski, 1994; Kaczorowski, Sektas, 1996].

Успешное "прохождение" ДНК-полимеразой "трудных" участков за счет тех или иных описанных выше ухищрений является только половиной дела, поскольку в новосинтезированной комплементарной цепи ДНК также будут присутствовать эти участки с потенциальной вторичной структурой. После денатурации цепей ДНК в этих местах одноцепочечной ДНК образуются "шпилечные" структуры, заметно меняющие электрофоретическую подвижность такой молекулы ДНК. Результатом будет видимая на конечном радиоавтографе компрессия отдельных полос, не позволяющая их однозначное "прочтение". Проведение гель-электрофореза при повышенных температурах или с добавлением в буфер формамида в качестве дополнительного денатурирующего агента, кроме мочевины, в ряде случаев позволяет избежать эффект компрессии. Был также предложен способ ликвидации эффекта компрессии при электрофоретическом разделении продуктов секвенирующих реакций, заключающийся в проведении дополнительного этапа модификации цитозиновых остатков в новосинтезированной цепи ДНК с помощью химических реагентов, приводившей к невозможности формирования участков с сильной вторичной структурой [Ambartsumyan, Mazo, 1980]. Применение для этой цепи метоксиамина и бисульфита было основано на раннем наблюдении других авторов [Sverdlov et al., 1974] по превращению цитозиновых оснований в N⁴-метокси-5,6-дигидро-6-сульфоцитидин под действием метабисульфита натрия и О-метилгидрооксиламингидрохлорида. Однако такой подход нельзя было назвать достаточно удобным, поскольку он требовал дополнительных нежелательных усилий по осаждению, растворению продуктов секвенирующих реакций.

В то же время потенциальную проблему компрессии полос при их разделении в секвенирующем полиакриламидном геле, характерную, главным образом, для GC-богатых ДНК, можно разрешить уже на этапе проведения терминирующих реакций путем использования некоторых аналогов природных субстратов, формирующих более слабые связи со своими комплементарными основаниями. Поскольку GC-пары формируют, как известно, между собой три водородные связи против двух для АТ-пар, то, следовательно, исключения или уменьшения компрессии возможно добиться, используя при построении комплементарной цепи ДНК аналогов дГТФ. Дезоксиинозинтрифосфат является одним из таких наиболее часто применяемых для секвенирования GC-богатых ДНК нуклеотидов [Mills, Kramer, 1979; Gough, Murray, 1983]. Благодаря отсутствию экзоциклической NH₂-группы он не способен к формированию третьей водородной связи с остатком цитозина, что приводит к заметному уменьшению температуры плавления таких цепей ДНК. Таким образом, новосинтезированные фрагменты ДНК, содержащие вместо дГМФ дИМФ, формировать структуры типа "шпилек" во время их разделения в полиакриламидном геле при повышенной температуре и в присутствии мочевины как денатурирующего агента не будут. Результатом явится четкая картина полос секвенируемой ДНК, пригодная для их однозначного "прочтения". Некоторыми отрицательными моментами использования дИТФ является его плохое узнавание некоторыми ДНК-полимеразами и соответственно относительно слабое включение, что приводит к неэффективному построению комплементарной цепи ДНК и уменьшает количество нуклеотидов, которое можно определить в одном эксперименте, а также иногда образованию "пауз", следующих за включенным дИМФ и видимых как пустое место на заключительном радиоавтографе. В связи с не столь эффективным включением дИМФ в ДНК реакционная смесь при проведении терминации по G-типу с участием дИТФ содержит весьма высокую концентрацию последнего, превышающую таковую для дГТФ в 2-4 раза (для разных ДНК-полимераз), а также 100 мкмоль и более его дидезоксипроизводного ддИТФ или значительно уменьшенное количество ддГТФ. Кроме этого, из-за "пауз" (не являющихся результатом компрессии) в отдельных случаях рекомендуется пя-тидорожечное секвенирование, где G-тип реакции проводится параллельно как с гуанином, так и с инозином, причем следует иметь в виду, что подвижность фрагментов с дИМФ несколько выше таковых с дГМФ.

Другим изостерическим аналогом дГТФ при проведении терминирующих реакций служит его деазапроизводное 7-деаза-2'-дезоксигуанозин-5'-трифосфат, успешное применение которого для секвенирова-ния ДНК с очень высоким GC-составом было почти одновременно продемонстрировано двумя группами исследователей [Mizusawa et al., 1986; Barr et al., 1986]. Несмотря на то, что 7-деаза-2'-дезоксигуанозин-5'-монофосфат образует с комплементарным ему дЦМФ также три водородные связи и характеризуется лишь чуть более низкой температурой плавления цепи ДНК, отсутствие азота в 7-м положении пуринового кольца препятствует формированию Хугстиновских пар и, таким образом, ослабляет взаимодействие между основаниями. Использование 7-деаза дГТФ, а не дИТФ в некоторых случаях предпочительнее, так как он лучше узнается большинством ДНК-полимераз и не требует включения в реакционную смесь 7-деаза ддГТФ, тогда как ддИТФ должен обязательно присутствовать при проведении терминирующих реакций. В то же время дИМФ образует более слабые связи с комплементарным ему цитидином и в ряде случаев оказывается все же предпочительнее [Tabor, Richardson, 1987a].

Также было показано исключение компрессии полос ДНК за счет использования при построении комплементарной цепи нового производного цитидина - N⁴-метил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата [Li et al., 1993]. Как утверждают авторы, это соединение, эффективно включаемое Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы I, Taq ДНК-полимеразой и секвеназой, в некоторых случаях было способно ликвидировать компрессию, с которой не справлялся 7-деаза-дГТФ. В то же время N⁴-метил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфат довольно часто вызывал образование ложной терминации строящейся цепи ДНК и одновременное присутствие в реакционной смеси обычного дЦТФ и этого его производного приводило из-за их разной подвижности к некоторому расширению полос, ухудшающему общую разрешающую способность метода.

Заметное улучшение качества секвенирования ДНК как в ручном, так и в автоматическом режимах удалось достичь путем проведения реакций терминирования в присутствии 7-деаза-дГТФ, а также 7-деаза-дАТФ, что позволило исключить аномалии в подвижности фрагментов ДНК из-за компрессии полос, вызванных вкладом обоих (дГМФ и дАМФ) нуклеотидов [Jensen et al., 1991]. При этом авторы отметили формирование более равномерных по высоте пиков фрагментов ДНК при их секвенировании в автоматическом секвенаторе с помощью флуоресцентной метки.

Недавно было отмечено, что обычно (более 70% случаев) компрессия вызывается определенными последовательностями нуклеотидов, консенсус которых был выведен как 5'-YGNAR-3' или 5'-YGNNAR-3' [Yamakawa, Ohara, 1997]. Причем во многих случаях в указанной консенсусной последовательности под N скрываются остатки аденина. В связи с этим в цитируемой работе для устранения эффекта компрессии проведение терминирующих реакций осуществлялось с использованием как 7-деаза дГТФ, так и 7-деаза-дАТФ. Отсутствие азота в положении 7 пуринового кольца у 7-деаза-дАТФ не позволяет образовываться неуотсон-криковским парам G-A, которые, как считается, играют важную роль в формировании вторичной структуры. Авторы сообщают об успешном преодолении проблемы компрессии после разделения продуктов реакции в автоматическом секвенаторе. Также при автоматическом флуоресцентном секвенировании ДНК было обнаружено, что замена обычных дНТФ на их тиопроизводные ((5'-O-(1-тиотрифосфат) дНТФ) при проведении терминирующих реакций позволяет частично разрешить проблему компрессии [Lee at al., 1992].

Несмотря на то, что классические терминаторы построения цепи ДНК ддНТФ вполне соответствуют запросам экспериментаторов, продолжается поиск и синтез новых производных нуклеотидов, узнаваемых ДНК-полимеразами и способных вызывать терминацию новосинтезируемой цепи ДНК. Было показано, что 2',2,-дидезокси-3'-аминонуклеозид-5'-трифосфаты являются сильными ингибиторами построения цепи ДНК и могут использоваться в качестве специфических терминаторов при секвенировании ДНК с помощью ДНК-полимеразы I [Chidgeavadze et al., 1984].

Можно отметить также синтез 8 производных дНТФ с модификацией 3' -положения сахара, среди которых только 3 удовлетворяли основным требованиям, предъявляемым к терминаторам [Metzker et al., 1994]. Первые два представляли собой 3'-О-метил-дАТФ и 3'-О-метил-дТТФ, узнаваемые большинством применяемых для секвенирования ДНК-полимераз и показали вполне сравнимую картину секвенируемых полос ДНК после их разделения в секвенирующем гель-электрофорезе. Тогда как уникальность третьего терминатора 3'-O-(2-нитробензил)-дАТФ заключается в его чувствительности к УФ-свету, в результате воздействия которого отщепляется блокирующая группа на 3'-конце дезоксирибозы и дальнейший синтез цепи ДНК может быть продолжен. Как считают авторы цитируемой работы, разработка для каждого азотистого основания подобных терминаторов, которые после определенных воздействий (например, УФ-светом) будут поддерживать дальнейшее удлинение цепи ДНК, может лечь в основу нового подхода к секвенированию ДНК, более подробно рассматриваемого в специальной главе 12.

Завершая данный раздел, видимо, необходимо отметить, что долгое время терминирующие реакции проводились в запаиваемых стеклянных капиллярах, как и в оригинальной работе Сэнгера и соавт. [Sanger et al., 1977а]. Так, например, еще в 1982 г. Хонг в своей методической статье упоминает о проведении секвенирующих реакций в стеклянных капиллярах [Hong, 1982]. В это, наверное, сейчас трудно поверить, но, такое, казалось бы, незначительное событие как переход к полипропиленовым реакционным 1,5 мл пробиркам, осуществленный Хонгом и соавт. в 1983 г. [Biggin et al., 1983], оказало значительное влияние на дальнейшее развитие метода ферментативного секвенирования, упростив проведение центрального этапа этого метода [Hong, 1987] и заложив тем самым основы автоматизации процесса секвенирования ДНК. Следующий шаг, заключавшийся в проведении терминирующих реакций уже в микротитраторных планшетах, был более ожидаем [Bankier et al., 1987; Koop et al., 1990].