ДНК-полимераза


Значение термина ДНК-полимераза в Энциклопедии Научной Библиотеки



ДНК-полимераза - Большинство ДНК-полимераз являются матрицезависимыми ферментами, т.е. синтезирующими вторую комплементарную цепь по уже существующей. Примером других может служить
Ферментативное действие ДНК-полимеразы
терминальная нуклеотидтрансфераза, осуществляющая синтез одноцепочечной ДНК произвольной последовательности путем последовательного присоединения нуклеотидов к 3'-концу. (Собственно нематричная активность показана и для ряда других ДНК-полимераз (обратная транскриптаза, Taq ДНК-полимераза и др.), однако они присоединяют только по одному лишнему нуклеотиду на растущий 3'-конец [Clark, 1988].) Различают ДНК-зависимые и РНК-зависимые ДНК-полимеразы. Так, из группы А ферментов, для которых матрицами являются цепи ДНК, в секвенировании применяются ДНК-полимераза I. E. coli, Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I. E. coli, ДНК-полимераза фага Т7, некоторые термостабильные ДНК-полимеразы и различные конструкции многих этих ферментов, полученные в том числе генно-инженерным путем. Полимеразы, синтезирующие цепь ДНК по матрице РНК, называются еще обратными транскриптазами или ревертазами и первоначально применялись для ферментативного секвенирования молекул РНК. Следует отметить, что пригодность какой-либо ДНК-полимеразы для целей секвенирования ДНК заключается в ее соответствии определенным требованиям, к ней предъявляемым, которые и будут рассмотрены ниже.

ДНК-полимеразы являются ферментами двойного действия, поскольку наряду с полимеразной активностью, выражающейся в последовательном присоединении нуклеотидов к растущей цепи ДНК в направлении 5' → 3', они катализируют реакцию пирофосфоролиза (более подробно рассмотренную при описании модифицированных Т7 ДНК-полимераз), а также имеют еще и 3' → 5'-экзонуклеазную активность, заключающуюся в удалении присоединенных нуклеотидов и выполняющую редактирующие функции. Некоторые полимеразы имеют 5' → 3'-экзонуклеазную активность, призванную осуществлять в клетке репарирующие функции уже существующей цепи ДНК (рис.).

И 5' → 3', и 3' → 5'-экзонуклеазные активности ДНК-полимераз мешают проведению секвенирующих реакций и крайне нежелательны. Так, 3' → 5'-экзонуклеазная редактирующая активность будет удалять только что включенные нуклеотиды, в том числе нуклеотиды с дидезоксирибозой (хотя и с меньшей скоростью), приводя в результате к неспецифической терминации растущих цепей ДНК и невозможности однозначного прочтения радиоавтографа геля. 5' → 3'-экзонуклеазная активность может оказывать даже более серьезное отрицательное влияние на результаты секвенирования ДНК, заключающееся в удалении нуклеотидов на 5' -конце праймера, являющегося частью вновь синтезируемой цепи и приводя, таким образом, к образованию гетерогенных 5'-концов разделяемых гель-электрофорезом фрагментов ДНК. Результатом будет та же нечитаемая картина полос секвенируемой ДНК или даже полное ее отсутствие при использовании в качестве метки олигонуклеотидного праймера, меченного по 5' -концу.

Что касается непосредственно самой полимеразной активности, то к ее важным характеристикам, различающимся у разных ферментов, относятся скорость полимеризации и процессивность. Последняя выражается в количестве нуклеотидов, которые присоединит так или иная ДНК-полимераза, прежде чем произойдет ее диссоциация с матрицы ДНК. Ни одна полимераза не может строить цепь ДНК бесконечно и рано или поздно любая полимераза диссоциирует с матрицы ДНК. Но при секвенировании ДНК, чем ниже будет процессивность используемого фермента, чем чаще будет прерываться синтез новой цепи и в результате возможного невозобновления его в том же месте будут образовываться неспецифически терминированные фрагменты. Скорость полимеризации измеряется в количестве присоединенных нуклеотидов за 1 с при оптимальной температуре для каждого фермента, и, хотя этот показатель при секвенировании ДНК и не является критическим, для синтеза новых цепей ДНК все же удобнее использовать ферменты, завершающие реакцию за непродолжительное время. Еще одной важной для секвенирования ДНК чертой ДНК-полимераз является способность того или иного фермента включать в растущую цепь модифицированные основания, как, например, дидезоксинуклеотидтрифосфаты.

Таким образом, некий идеальный фермент для секвенирования ДНК должен был бы быть, во-первых, относительно дешевым и при этом характеризоваться высокой полимеразной активностью, включая и процессивность и скорость полимеризации, отсутствием всяких экзо-нуклеазных активностей, не привередливостью к различным модифицированным аналогам нуклеотидов, а также устойчивостью к повышенным температурам. Забегая вперед, можно сказать, что и секвеназа (версия 2.0) и термосеквеназа во многом отвечают приведенным выше требованиям, различаясь по своим температурным оптимумам ферментативной активности, причем справедливости ради следует отметить, что для секвенирования ДНК далеко не всегда необходимо проведение реакций при повышенных температурах и даже некоторые стратегии секвенирования ДНК возможны только с использованием ферментов, работающих при комнатных или слегка повышенных (37 °С) температурах. Более того, как это будет видно из дальнейшего изложения, некоторые, казалось бы, нежелательные черты тех или иных ферментов в различных стратегиях секвенирования ДНК могут оборачиваться во благо.

Ферментативные (экзонуклеазные) активности некоторых ДНК-полимераз

ФерментЭкзонуклеазная активность
5'→3'3'→5'
ДНК-полимераза IE. coli++
Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I Е. coli-+
Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I Е. coli, мутантная форма, экзо---
AMV-ревертаза (обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц)--
MMLV-ревертаза (обратная транскриптаза Молони вируса лейкемии мышей)--
В st ДНК-полимераза Bacillus stearothermophilus+-
Т7 ДНК-полимераза (нативная)-+
Секвеназа (версия 1.0) (модифицированная Т7 ДНК-полимераза)--
Секвеназа (версия 2.0) (модифицированная Т7 ДНК-полимераза)--
Taq ДНК-полимераза Thermus aquaticus (термостабильная)+-
Tth ДНК-полимераза Thermus thermophilus (термостабильная)+-
Tub ДНК-полимераза Thermus flavus (термостабильная)+-
Taq ДНК-полимераза Thermus aquaticus (модифицированная)--
Tth ДНК-полимераза Thermus thermophilus (модифицированная)--
Deep Vent R(exo-) ДНК-полимераза Pyrococcus sp. (модифицированная)--
Термосеквеназа (мутантная форма Taq ДНК полимеразы)--
AmpliTaq FS ДНК-полимераза (мутантная форма Taq ДНК-полимеразы)--


В табл. приведены отдельные сведения о свойствах некоторых ДНК-полимераз, наиболее широко применявшихся и применяющихся ныне для секвенирования ДНК. Кроме этих характеристик, определенное значение имеет и термостабильность фермента, более подробно рассмотренная в процессе дальнейшего изложения.

Несмотря на значительные различия упомянутых выше ДНК-зависимых ДНК-полимераз, все они относятся к так называемому Ро11-семейству ферментов и имеют определенное сходство в организации белковой молекулы [Bernard et al., 1989; Blanco et al., 1990, 1992; Reha-Krantz, 1992; Astatke et al., 1995]. Аналогично ДНК-полимеразе I E. coli все эти ферменты состоят из трех доменов, два из которых ответственны за экзонуклеазные активности, тогда как третий домен выполняет полимеразные функции (рис.). Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей различных ДНК-полимераз позволил выявить несколько высококонсервативных участков в этих доменах [Blanco et al., 1991].

Как можно видеть из приведенных схем, наибольшее число консервативных участков локализовано в имеющемся у всех ферментов (что вполне естественно) домене, отвечающем за полимеразную активность. Некоторые из этих участков связываются с ДНК, а другие с дНТФ и ионами магния. Этому домену предшествует домен, выполняющий редактирующие функции в виде 3' → 5'-экзонуклеазной активности. У термостабильных ДНК-полимераз в этом домене имеется только один консервативный участок (Taq ДНК-полимераза) или они все отсутствуют (Bst ДНК-полимераза), вследствие чего оба этих фермента лишены подобной редактирующей активности. NH2-терминальный домен у ДНК-полимеразы I несет репарирующую 5' → 3'-экзонуклеазную активность. Подобную активность проявляют обе упомянутые выше термостабильные ДНК-полимеразы, что, вероятно, объясняет обнаруженную у них некоторую гомологию этого участка с аналогичным у ДНК-полимеразы I. Что касается большинства ДНК-полимераз, модифицированных с целью их большей пригодности для ферментативного секвенирования ДНК либо ограниченным протеолизом, либо специально созданных генно-инженерным путем, то их объединяет общая черта, заключающаяся в удалении имеющейся у их предшественников 5' → 3'-экзонуклеазной активности. Путем делеции нескольких аминокислотных остатков во втором экзонуклеазном домене Т7 ДНК-полимеразы была убрана имевшаяся 3' → 5'-экзонуклеазная активность. Сайт-направленный мутагенез двух аминокислот в экзонуклеазном домене Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I привел к удалению 3' → 5'-экзонуклеазной активности этого фермента. Как можно представить из приведенных схем, столь разные структурные организации рассматриваемых ферментов не могли не сказаться на особенностях их ферментативного действия, чему и будет посвящено дальнейшее изложение.

ДНК-полимераза I E. Coli, имеющая весьма низкую процессивность (10-30 нуклеотидов) и невысокую скорость полимеризации (45 нуклеотид/с) и обладающая, кроме полимеразной (5' → 3'), еще и 5' → 3' и 3' → 5'-экзонуклеазными активностями, использовалась для секвенирования ДНК весьма ограниченно [Maat, Smith, 1978]. Некоторым преимуществом этого подхода с применением ДНК-полимеразы I в качестве секвенирующего фермента являлось отсутствие необходимости приготовления одноцепочечной матрицы ДНК, учитывая, что в то время (как это уже описывалось в разделе 2.2) эта процедура была весьма трудоемкой. В качестве затравочной молекулы, если так можно выразиться, служила имеющаяся вторая цепь ДНК. Принцип секвенирования ДНК с помощью нативного фермента ДНК-полимеразы I заключался в том, что после внесения ДНКазой I "ников" в секвенируемый фрагмент, меченный по 5'-концу с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4, 5' → 3'-экзонуклеазная активность полимеразы удаляла нуклеотиды на 5'-конце "ника", а полимеразная присоединяла их к его растущему 3'-концу и, поскольку в реакционной смеси присутствовали дидезоксинуклеотид трифосфаты, при их включении происходило ингибирование дальнейшего синтеза части "ник-транслируемых" фрагментов ДНК. Так что при секвенировании ДНК этим методом обычно мешающая 5' → 3'-экзонуклеазная активность фермента была просто необходима. Авторы утверждают, что значительной потери радиоактивной метки на 5'-конце секвенируемого фрагмента ДНК они не отмечали. Существовала модификация этого подхода, где специальное добавление ДНКазы I оказалось необязательным [Seif et al., 1980].

В ДНК-полимеразе I с помощью частичного протеолиза субтилизином была убрана 5' → 3'-экзонуклеазная активность и ее большой фрагмент, называемый Кленовским [Klenow et al., 1971], нашел широкое применение в секвенировании ДНК и на протяжении более чем десяти лет он оставался основным ферментом при проведении терминирующих реакций. К сожалению, в некоторых препаратах Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I иногда сохранялась незначительная 5' → 3'-экзонуклеазная активность и получаемая с помощью такого фермента картина полос ДНК на радиоавтографе секвенирующего геля часто бывала неудовлетворительной. Значительное улучшение качества секвенирования ДНК удалось добиться при использовании рекомбинантного фермента, представляющего собой клонированный фрагмент гена ДНК-полимеразы I, соответствующий Кленовскому, и заведомо не несущего 5' → 3'-экзонуклеазной активности [Joyce, Grindley, 1983]. Однако такой фермент, нарабатываемый с клонированного фрагмента гена в штамме-суперпродуценте, несмотря на свою более высокую степень чистоты и отсутствие 5' → 3'-экзонуклеазной активности, сохранил свои прочие прежние (не лучшие для секвенирования ДНК) свойства. Позднее с помощью сайтнаправленного мутагенеза была произведена замена двух аминокислотных остатков аспарагиновой кислоты в 355 положении и глутаминовой кислоты в 357 положении в обоих случаях на остатки аланина в экзонуклеазном домене Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I [Derbyshire et al, 1988]. Такой мутантный (D355A, Е357А) фермент стал характеризоваться отсутствием остававшейся у него до этого 5' → 3'-экзонуклеазной активности и получил наименование Кленовский фрагмент, экзо-. Однако отсутствие у него редактирующей 5' → 3'-экзонуклеазной активности привело к повышенному уровню нематричного синтеза, заключающегося в добавлении на 3'-конец одного дополнительного выступающего нуклеотида [Clark et al., 1987]. Хотя и сам Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I обладает такой же, но менее ярко выраженной способностью [Clark, 1988]. Для целей секвенирования ДНК отсутствие обоих экзонуклеазных активностей может приводить только к улучшенным результатам, но в то же время при секвенировании коротких фрагментов ДНК необходимо учитывать возможность добавления дополнительного нуклеотида на их 3'-конец.

Как уже отмечалось выше, к отрицательным чертам ДНК-полимеразы, с помощью которой предполагается осуществлять секвенирование (кроме упомянутой экзонуклеазной активности), относятся следующие: низкая процессивность, малая скорость полимеризации, высокая избирательность по отношению к дНТФ и их аналогам, включаемым в среднем в тысячу раз хуже природных. Все эти черты в полной мере относятся к Кленовскому фрагменту ДНК-полимеразы I, получаемому как путем протеолиза субтилизином, так и нарабатываемому с помощью штамма-суперпродуцента. Дополнительным отрицательным качеством этого фермента является его невысокая термостабильность и, как следствие, невозможность достоверного секвенирования GC-богатых участков с ярко выраженной вторичной структурой.

Справедливости ради следует отметить, что относительно недавно с помощью сайтнаправленного мутагенеза проведена модификация гена ДНК-полимеразы IE. coli, вернее Кленовского фрагмента, путем замены аминокислоты фениаланин в 762 положении (нумерация приведена для нативного фермента) на тирозин, что позволило резко снизить избирательность такого генно-инженерного фермента по отношению к включаемым нуклеотидным аналогам [Tabor, Richardson, 1995]. Ранее также было показано, что присутствие в реакционной смеси ионов Mn2+ вместо Mg2+ в 100 раз уменьшает избирательность Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I по отношению к различным дНТФ и их модифицированным аналогам [Tabor, Richardson, 1989a]. Однако в настоящее время для Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I как секвенирующего фермента это уже не является актуальным и имеет скорее теоретический интерес. Необходимо признать, что в последние годы Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I находит весьма ограниченное применение в секвенировании ДНК, поскольку и обнаружены и созданы новые ДНК-полимеразы, превосходящие его по всем параметрам. Недавняя работа Ричардсона и соавт., выявивших тиоредоксинсвязывающий домен, протяженностью 76 аминокислот, у Т7 ДНК-полимеразы и создавших на его основе новый рекомбинантный фермент Klenow-TBD - Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I с добавленным в него данным доменом, показала заметное увеличение процессивности этой химерной ДНК полимеразы [Bedford et al., 1997]. Однако, как отмечают сами авторы, теоретически гораздо больший эффект можно ожидать от добавления этого тиоредоксинсвязывающего домена в термостабильную Taq ДНК-полимеразу или ее производные, поскольку, хорошо известно, что тиоредоксин способствует весьма заметному увеличению процессивности Т7 ДНК-полимеразы [Tabor et al., 1987] и в связи с этим можно ожидать подобного эффекта и для других ДНК-полимераз, относящихся к этому семейству Poll-ферментов. Это, кстати, подтверждают и результаты по созданию химерного фермента Klenow-TBD с данным доменом. Но при этом важным условием является сохранение термостабильности этих ферментов после введения в них дополнительного домена.

Другим ферментом для секвенирования ДНК являются обратные транскриптазы, первоначально использовавшиеся для ферментативного секвенирования молекул РНК методом терминации строящейся цепи ДНК с помощью дидезоксинуклеотидтрифосфатов [McGeoch, Turnbull, 1978; Zimmern, Kaesberg, 1978; Bina-Stein et al., 1979]. Поскольку фермент способен к использованию в качестве матрицы и цепи ДНК, то позднее он стал применяться и для секвенирования некоторых матриц ДНК с гомополимерными G/C-участками, которые были трудноразрешимыми с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I [Mierendorf, Pfeffer, 1987]. Секвенирование протяженных нуклеотидных участков из одних цитозиновых остатков также лучше удавалось с помощью обратных транскриптаз. Обратная транскриптаза Молони вируса лейкемии мышей была менее пригодна для этих целей, нежели обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц [Mierendorf, Pfeffer, 1987]. Для обратных транскриптаз, в целом, характерны те же недостатки, что и для Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I. Как то, низкая термостабильность, даже еще более низкая скорость элонгации, чем у Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I. Однако процессивность обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц несколько выше и составляет несколько сотен нуклеотидов при скорости полимеризации всего 5 нуклеотид/с. Что касается избирательности включения в растущую цепь ДНК нуклеотидных аналогов, то ревертазы включают их лишь в десять раз хуже истинных модифицированных нуклеотидов.

Введение в практику секвенирования модифицированных Т7 ДНК-полимераз (известных также под названием секвеназа, версия 1.0 и секвеназа, версия 2.0), являющихся химически и генетически измененными Т7 ДНК-полимеразами соответственно [Tabor, Richardson, 1987a; Tabor, Richardson, 1989b], заметно изменило сложившиеся представления о производительности метода ферментативного секвенирования ДНК и окончательно оттеснило на второй план метод секвенирования ДНК путем химической деградации по Максаму-Гилберту. Этому, однако, предшествовали серьезные исследования фермента Т7 ДНК-полимеразы и составляющих ее белков.

Известно, что данный фермент вырабатывается в клетках Е. coli после инфицирования ее бактериофагом Т7 (Под Т7 ДНК-полимеразой, в дальнейшем изложении, а также под уже упоминавшейся выше, подразумевается комплекс двух полипептидов, представляющих собой белковый продукт гена 5 бактериофага Т7 и продукт гена trxA E. coli.). Собственно сама полимеразная активность, да и 3' → 5'-экзонуклеазная активность фермента заключена в продукте гена 5 бактериофага (80 кДа), но процессивность его крайне низка, зависит от многих факторов и составляет не более 50 нуклеотидов, однако образуемый очень прочный комплекс с маленьким (около 12 кДа) белком тиоредоксином, кодируемый бактериальным геномом, резко увеличивает этот показатель [Tabor et al., 1987]. Что касается самого белка тиоредоксина, то он не имеет ни ДНК-поли-меразной, ни экзонуклеазной активностей и только стабилизирует комплекс Т7 ДНК-полимеразы и матрицы ДНК с затравкой [Huber et al., 1987]. Есть сведения о том, что тиоредоксин защищает связываемые им регионы Т7 ДНК-полимеразы от протеолиза [Yang, Richardson, 1996]. Проведенное детальное исследование "ошибок", совершаемых Т7 ДНК-полимеразой отдельно и в комплексе с тиоредоксином, свидетельствует о серьезном влиянии этого белка на свойства самой полимеразы [Kunkel et al., 1994]. Была показана зависимость скорости полимеризации фермента от наличия SSB-белка, из которой видно, что при добавлении данного белка скорость элонгации возрастает от 110 до 750 нуклеотид/с. [Tabor et al., 1987]. Другим важным свойством фермента явилась его "неразборчивость" по отношению к включаемым нуклеотидам. Так, в отличие от ревертаз и Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы IT7 ДНК-полимераза включала модифицированные нуклеотиды (дидезоксинуклеотидтрифосфаты и прочие аналоги) с эффективностью лишь в два раза меньшей, чем немодифицированные дНТФ [Tabor, Richardson, 1987a].

Считается, что в связи с высокой 3' → 5'-экзонуклеазной активностью (значительно превосходящей таковую Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I) нативная Т7 ДНК-полимераза не может использоваться для проведения секвенирующих реакций. Однако в литературе встречаются сведения об успешном использовании этого фермента для целей секвенирования [Kristensen et al., 1988]. Кроме этого, шведская фирма Pharmacia на протяжении ряда лет поставляла особым образом очищенную нативную Т7 ДНК-полимеразу, пригодную для секвенирования ДНК ферментативным методом. Помимо высокой очистки фермента, значительную роль в его пригодности для проведения терминирующих реакций, по-видимому, играет состав реакционной смеси с достаточно высокими концентрациями всех дНТФ.

Несмотря на различие в скорости протекания реакции полимеризации и экзонуклеазного отщепления присоединенных нуклеотидов, все же позволяющее использовать нативныи фермент Т7 ДНК-полимеразу для секвенирования ДНК, удаление экзонуклеазной активности сделало фермент еще более пригодным для этих целей. Первая модифицированная Т7 ДНК-полимераза, называемая секвеназой, версия 1.0 была создана путем избирательного окисления ряда аминокислот (часть из которых, вероятно, гистидины) в экзонуклеазном домене фермента под действием молекулярного кислорода, солей железа и редуцирующего агента [Tabor, Richardson, 1987b]. В результате такого селективного окисления экзонуклеазная активность модифицированной Т7 ДНК-полимеразы сохранилась на уровне лишь 1,3% от таковой у нативного фермента [Tabor, Richardson, 1989b]. Модифицированная таким образом Т7 ДНК-полимераза характеризовалась такой же высокой процессивностью, что и нативныи фермент, но при этом скорость полимеризации, измеренная без SSB-белка, выросла в три раза и составила около 300 нуклеотид/с. [Tabor, Richardson, 1987a]. Благодаря всем этим замечательным свойствам секвеназы, резко повысилась производительность метода ферментативного секвенирования ДНК. Такими составляющими повышения производительности явились эффективное построение новой цепи ДНК (свыше 2000 нуклеотидов против 200-500 для Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I или обратных транскриптаз), выходившее далеко за рамки возможности их разделения обычным секвенирующим электрофорезом; значительно меньшее количество "стопов" ввиду высокой процессивности фермента; легкое "безошибочное" "чтение" радиоавтографов секвенирующих гелей благодаря достаточно равномерному включению всех дидезоксинуклеотидтрифосфатов (в отличие от Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I, для которого были разработаны даже специальные правила по чтению отдельных слабых полос на радиоавтографе). Использование секвеназы заставило пересмотреть некоторые стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК, рассчитанные на получение субклонов с фрагментами ДНК определенной длины в сторону заметного увеличения последней.

Все же остаточная экзонуклеазная активность, присущая химически модифицированной Т7 ДНК-полимеразе, в отдельных случаях затрудняла секвенирование и в связи с этим были приложены значительные усилия по ее практически полному удалению [Tabor, Richardson, 1989b]. С этой целью был проведен сайтнаправленный мутагенез клонированного гена белка 5 бактериофага Т7 с помощью целого ряда олигонуклеотидных праймеров. Полученные при этом результаты свидетельствуют, что множественные замены отдельных аминокислот (преимущественно, гистидинов, аргининов и лизинов) в экзонуклеазном домене фермента снижают уровень экзонуклеазной активности до 0,001% от таковой нативной Т7 ДНК-полимеразы. Однако еще большим снижением экзонуклеазной активности (<10-6%) характеризовалась конструкция с делетированным участком гена белка 5 длиной 84 пн или 28 аминокислотных остатков, обозначения как Δ28 (Lys118-Arg145) [Tabor, Richardson, 1989b]. Дополнительным основанием для введения в практику секвенирования именно этого варианта генетически модифицированной Т7 ДНК-полимеразы, широко известной сейчас под названием секвеназа, версия 2.0, явилась ее наиболее высокая полимеразная активность среди прочих исследуемых генно-инженерных конструкций и превосходящая таковую нативного фермента в 9 раз.

Продолжающиеся исследования особенностей ферментативного действия генетически модифицированной Т7 ДНК-полимеразы позволили добиться эффекта уменьшения избирательности фермента по отношению к нуклеотидным аналогам. Было показано, что присутствие в реакционной смеси ионов Mn2+ вместо Mg2+ в среднем в 4 раза уменьшает избирательность включения тех или иных модифицированных оснований в растущую цепь ДНК [Tabor, Richardson, 1989a]. В то же время ионы Mn2+ несколько уменьшали процессивность модифицированной Т7 ДНК-полимеразы, что, впрочем, было легко преодолеть, весьма незначительно меняя состав реакционной среды. В цитируемой работе сравнительный анализ высоты пиков, соответствующих флуоресцентно меченным фрагментам ДНК, выявляемым при их секвенировании в автоматическом секвенаторе, убедительно продемонстрировал еще более равномерное включение в новую цепь ДНК всех четырех дидезоксинуклеотидтрифосфатов в присутствии ионов Mn2+. В этих условиях разброс высоты соседних пиков не превышал 20%, что оказалось наиболее важным для автоматического секвенирования ДНК. Исходя из такой равномерной высоты пиков было предложено при секвенировании геномной (не клонированной) ДНК детектировать гетерозиготы, в которых бы высота какого-либо пика была бы в два раза меньше остальных [Tabor, Richardson, 1990].

Поскольку в присутствии ионов марганца секвеназа включала в растущую цепь ДНК дНМФ и ддНМФ в приблизительно равном соотношении, это послужило основой для разделения продуктов всех 4 терминирующих реакций в одной дорожке секвенирующего геля в автоматическом секвенаторе ДНК. Ступенчатое изменение в разных смесях концентрации соответствующих ддНТФ (как например 3 мкМ для ддГТФ; 1,5 мкМ для ддАТФ; 0,75 мкМ для ддТТФ и 0,37 мкМ для ддЦТФ) приводило в результате электрофоретического разделения к получению пиков разной высоты, которые укладывались в 4 группы по числу ддНТФ. Сопоставляя высоты пиков, можно было с высокой достоверностью восстановить нуклеотидную последовательность секвенируемого участка ДНК [Tabor, Richardson, 1990].

Отмечая эффект ослабления отдельных полос ДНК и даже полное их исчезновение на радиоавтографе геля при секвенировании секвеназой (не имеющей экзонуклеазной активности), Табор и Ричардсон впервые указали на возможный вклад пирофосфоролиза в этот процесс [Tabor, Richardson, 1990]. Известно, что реакция пирофосфоролиза, протекающая в присутствии неорганического пирофосфата представляет реакцию обратную полимеризации. В свою очередь сам пирофосфат образуется при реакции полимеризации в процессе присоединения дНТФ путем превращения последнего в дНМФ и отщепления от него пирофосфата. Пирофосфоролиз находится в равновесии, когда концентрация присутствующих в реакционной смеси дНТФ достаточно высока, чтобы поддерживать скорость синтеза равной скорости образования новых трифосфатов. Хотя и реакции пирофосфоролиза и экзонуклеазной деградации приводят к одинаковому эффекту - удалению оснований на 3'-конце растущей цепи ДНК, они принципиально отличаются по субстратной зависимости и по конечному продукту. Так, как видно из упрощенной схемы (рис.) протекания пирофосфоролиза и экзонуклеазной деградации, происходящих в присутствии двухвалентных катионов (Mg2+ или Mn2+), пирофосфоролиз приводит к образованию вновь одного дНТФ и укорачивает растущую цепь ДНК на один нук-леотид, а под действием экзонуклеазы также укорачивается цепь ДНК, но при этом образуется дНМФ. В случае, если в данном примере последним присоединенным нуклеотидом было бы его дидезоксипроизвод-ное, то соответственно вместо дНТФ и дНМФ в реакционной среде будут присутствовать ддНТФ и ддНМФ.

Проведенный детальный анализ исчезновения или значительного ослабления отдельных полос при секвенировании ДНК секвеназой подтвердил роль пирофосфоролиза в этом процессе [Tabor, Richardson, 1990]. Дальнейшее исследование скорости секвеназного пирофосфоролиза показало, что в неких модельных условиях его скорость в 1000 раз ниже скорости полимеризации [Ruan et al., 1990]. В реальных условиях проведения секвенирующих реакций с дидезокси-ингибиторами, где концентрация пирофосфата существенно ниже, пирофосфоролиз будет протекать со значительно меньшей скоростью. Такая, казалось бы, огромная разница в скоростях реакций полимеризации и пирофосфоролиза не должна была бы приводить к отрицательному эффекту, но тем не менее при более продолжительной (15-60 мин), чем обычно, инкубации при проведении терминирующих реакций исчезновение или ослабление отдельных полос было весьма заметно. Таким образом, был сделан вывод о зависимости пирофосфоролиза отдельных нуклеотидов в ДНК от окружающих их последовательностей [Ruan et al., 1990; Tabor, Richardson, 1990]. На рис. показан один из таких наиболее доступных для пирофосфоролиза сайтов. Считается, что дидезоксипроизводные менее подвержены пирофосфоролизу (как, впрочем, и экзонуклеазной деградации), чем природные нуклеотиды, однако при электрофоретическом разделении фрагментов ДНК, терминация которых произошла при включении в цепь ДНК ддНМФ, отщепление дидезоксинуклеотидов будет более заметно (особенно при использовании в качестве меченной молекулы именно дидезоксинуклеотидтрифосфатов) и поэтому в рассмотрение был взят именно такой участок с ддАМФ.

Сравнительный анализ многих сайтов, чувствительных к пирофосфоролизу, позволил составить некую консенсусную последовательность ДНК 5'-MGNMddN-3' (где М - А, С или Т; N - любой не дидезоксинуклеотидмонофосфат, a ddN - какой-либо дидезоксинуклеотидмонофосфат), потенциально подверженную атаке пирофосфатом с большей вероятностью [Ruan et al., 1990]. Поскольку скорость пирофосфоролиза зависит от наличия как пирофосфата, так и дНТФ и их концентраций в реакционной среде, а также времени протекания реакции полимеризации, самым простым способом уменьшить нежелательный эффект, вызываемый пирофосфоролизом, можно, сократив время реакции и/или увеличив концентрации дНТФ и ддНТФ, не нарушая при этом необходимые соотношения этих ингредиентов. Так, ввиду высокой скорости элонгации новой цепи ДНК под действием секвеназы секвенирующие реакции, включая этап мечения, вполне могут быть завершены в 5-6 мин. Что касается возможного увеличения концентрации дНТФ и ддНТФ в реакционной смеси, то это приведет к их неэкономному расходованию и потому нежелательно. Другим способом исключения пиро-фосфоролиза является удаление из реакционной смеси образующегося пирофосфата, что достаточно просто сделать, добавив в реакцию еще один фермент - неорганическую пирофосфатазу. Как видно из приведенной ниже формулы, этот фермент в присутствии двухвалентных катионов (магния или марганца) катализирует превращение молекулы пирофосфата в две молекулы ортофосфорной кислоты

P2O74- + H2O -(M2+→2HPO42-

Так, было показано, что добавление незначительных количеств дрожжевой неорганической пирофосфатазы в реакционную смесь при проведении терминирующих реакций полностью исключает пирофос-форолиз [Ruan et al., 1990; Tabor, Richardson, 1990]. При этом надо иметь в виду, что неорганическая пирофосфатаза должна быть высоко очищена и не содержать каких-либо возможных примесей нуклеаз.

Таким образом, генетически модифицированная Т7 ДНК-полимераза или секвеназа (версия 2.0) является практически идеальным ферментом для секвенирования ДНК с помощью дидезокситерминаторов, что подтверждается просто огромным количеством работ, определение нуклеотидных последовательностей в процессе выполнения которых осуществлено именно с помощью этого фермента.

Пожалуй, единственным недостатком генетически модифицированной Т7 ДНК-полимеразы является ее низкая термостабильность. Причем, этот недостаток становится заметен лишь при секвенировании GC-богатых последовательностей за счет формирования участков с сильной вторичной структурой. Для преодоления этого недостатка встречались рекомендации увеличить концентрацию фермента и несколько повысить температуру инкубации (до 45 °С) при проведении терминирующих реакций. И то и другое в отдельных случаях способствовало нормальному "прохождению" ферментом таких сложных участков. Однако участки с сохраняющейся при этой температуре вторичной структурой были неразрешимы. Становилось очевидным, что для определения нуклеотидных последовательностей с высоким содержанием GC-nap необходимо использование термостабильных ферментов.

Одним из таких достаточно широко применяемых ферментов была термостабильная ДНК-полимераза, выделенная из почвенной бактерии Bacillus stearothermophilus. Полученный путем расщепления субтилизином ее большой фрагмент, аналогичный Кленовскому, с успехом использовался при секвенировании ДНК с сильной вторичной структурой, поскольку довольно высокая температура инкубации (65 °С) способствовала расплетанию возникающих шпилечных структур [Ye, Hong, 1987]. Этими же авторами показано успешное использование данного фермента при секвенировании противоположной цепи ДНК посредством построения на первом этапе комплементарной без участия терминаторов [Lu et al., 1992], как это ранее было предложено для Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I [Hong, 1981]. Довольно высокая скорость полимеризации этого фермента, составляющая около 120 нуклеотид/с позволяла проводить мечение и терминацию в два этапа [McClary et al., 1991]. Не менее важной оказалась способность Bst-полимеразы (ее большого фрагмента) использовать при построении новой цепи модифицированные аналоги, такие как дИТФ и 7-деаза-дГТФ, что уменьшало компрессию полос ДНК при их разделении секвенирующим гель-электрофорезом [McClary et al., 1991]. К другим важным свойствам этого фермента можно отнести то, что он достаточно стабилен при хранении при комнатной температуре и после 14 сут при 25 °С Вst ДНК полимераза образовывала картины полос секвенируемой ДНК высокого качества [Lu et al., 1991]. Также было показано, что Bst-полимераза может храниться в высушенном виде вместе с остальными ингредиентами для ферментативного секвенирования ДНК в микротитраторных планшетах при -20 °С в течение недели и по крайней мере в течение ночи при комнатной температуре, что делало этот фермент пригодным для массовых анализов при помощи лабораторного робота [Earley et al., 1993]. Фермент оказался пригоден и для секвенирования нанограммовых количеств ДНК матрицы при использовании флуоресцентной метки [Mead et al., 1991].

Произведенные замены двух аминокислотных остатков тирозина в 5' → 3'-экзонуклеазном домене клонированного гена Bst ДНК-полимеразы на фенилаланин и аланин привели к удалению этой экзонуклеазной активности фермента, как и в случае субтилизинового протеолиза, и измененная таким образом Bst ДНК-полимераза была пригодна для проведения секвенирующих реакций [Riggs et al., 1996]. Замены двух остатков глицина на аспарагиновую кислоту у схожего фермента Вса ДНК-полимеразы привели к аналогичному эффекту [Ishino et al., 1995]. Здесь, видимо, следует отметить, что в настоящее время эта ДНК-полимераза из термофильного микроорганизма Bacillus caldotenax, ген который ранее был клонирован [Uemori et al., 1993], также используется в секвенировании ДНК и поставляется фирмой "PanVera Corporation" (США).

Анализ нуклеотидной последовательности гена Bst ДНК-полимеразы показал, что все три высококонсервативных участка, типичных для ДНК-полимераз, относящихся к Poll-семейству ферментов, в ее 3' → 5'-экзонуклеазном домене отсутствуют [Aliotta et al., 1996]. Проведенные биохимические тесты на наличие экзонуклеаз у нативной Bst ДНК-полимеразы и ее большого фрагмента показали, что только полноразмерный фермент содержал 5' → 3'-экзонуклеазную активность [Aliotta et al., 1996]. Авторы делают вывод, что редактирующая 3' → 5'-экзонуклеазная активность отсутствует у ряда ДНК-полимераз (и в том числе у термостабильной ДНК-полимеразы, выделенной из бактерии Thermus aquaticus, к рассмотрению которой мы как раз переходим), как бы в обмен на их повышенную термостабильность.

Термостабильная Taq ДНК-полимераза, выделенная из термофильной бактерии Thermus aquaticus, имеет температурный оптимум ферментативного действия около 72 °С и при этом сохраняет свою активность при 95 °С довольно продолжительное время. Значительная процессивность фермента (7600 нуклеотидов) и высокая скорость полимеризации (около 60 нуклеотид/с) делали Taq ДНК-полимеразу достаточно удобным ферментом для секвенирования ДНК, особенно ДНК с высоким содержанием GC-nap и сильной вторичной структурой. Обстоятельное исследование пригодности Taq ДНК-полимеразы для секвенирования ДНК и особенностей действия фермента были проведены Иннисом и соавт. [Innis et al., 1988]. К сразу замеченным недостаткам фермента можно было отнести его довольно высокую избирательность включения нуклеотидных аналогов, в связи с чем в реакционной смеси требовались весьма высокие концентрации последних. В то же время Taq ДНК-полимераза была способна включать 7-деаза-дГТФ, что способствовало исключению компрессии при разделении продуктов секвенирующих реакций гель-электрофорезом. Авторами было отмечено наличие ошибочно включаемых Taq ДНК-полимеразой нуклеотидов и даже неспецифической терминации в отсутствие ддНТФ при низкой концентрации какого-либо из дНТФ. Так, в результате проведения данной работы Иннисом и соавт. была показана принципиальная возможность секвенирования ДНК с помощью Taq ДНК-полимеразы как клонированных фрагментов ДНК, так и получаемых путем асимметричной ПЦР. Практически одновременно с цитируемой работой Петерсон [Peterson, 1988] опубликовал краткое сообщение о применении Taq ДНК-полимеразы и ее преимуществе по сравнению с секвеназой при секвенировании GC-богатых участков.

Кроме Taq ДНК-полимеразы, поставляемой многими фирмами, для секвенирования ДНК стали применять и другие термостабильные ферменты, выделенные из бактерий рода Thermus - Т. Thermophilus и Т. Flavus [Bechtereva et al., 1989; Rao, Saunders, 1992]. Последняя поставляется фирмой "Amersham International pic" (Англия), но уже под торговым именем Tub DNA Polymerase. Для Tth ДНК-полимеразы определена скорость полимеризации, составляющая около 25 нуклеотид/с [Carballeira et al., 1990]. Некоторые из этих ферментов до сих пор выделяются из природных штаммов, но, учитывая весьма высокую температуру выращивания, были клонированы гены некоторых термостабильных ДНК-полимераз Т. Aquaticus, Т. Thermophilus, Т. Flavus, Т. Caldophilus, [Lawyer et al., 1989; Akhmetzjanov, Vakhitov, 1992; Kwon et al., 1997]. Из других термостабильных ДНК-полимераз, не относящихся к Poll-семейству, для циклического секвенирования использовалась модифицированная Deep VentR®(exo-) ДНК-полимераза [Mariame, 1996], обнаруженная у архебактерии Ругосос-cus sp. из глубоководного термального источника и поставляемая фирмой "New England Biolabs, Inc.", а также некоторые другие.

Несмотря на доступность из коммерческих источников целого ряда термостабильных ДНК-полимераз бактерий рода Thermus, характеризующихся при этом близкими свойствами, все же из наиболее широко применяемым ферментом является Taq ДНК-полимераза как по историческим причинам, так и в силу своей большей изученности. Первое время при секвенировании ДНК использовали нативную Taq ДНК-полимеразу, характеризующуюся отсутствием 3' → 5'-экзонуклеазы, но имеющую 5' → 3'-экзонуклеазную активность. Несмотря на присутствующую экзонуклеазную активность качество секвенирования ДНК таким ферментом было вполне удовлетворительным и лишь незначительное двоение полос давало о себе знать. Поскольку 5' → 3'-экзонуклеазная активность у ферментов, относящихся к Poll-семейству, достаточно легко удаляется, то были созданы многочисленные специальные генно-инженерные конструкции Taq ДНК-полимеразы с делетированными участками экзонуклеазного домена, приходящегося на NH2-конец фермента. После удаления первых 235 аминокислот образовался фермент, названный Klen Taq ДНК-полимеразой и известный еще как ATaq ДНК-полимераза, для которого характерно отсутствие заметной экзонуклеазной активности [Barnes, 1992; Samols, Fuller, 1995]. Удаление 288 аминокислот с NH2-конца фермента Taq ДНК-полимеразы привело к аналогичному результату [Lawyer et al., 1993]. Такая укороченная Taq ДНК-полимераза или ее большой фрагмент длиной 544 аминокислотных остатка получила название Стоффельского фрагмента по имени одного из ее создателей. При этом, сохранив свои прежние свойства (кроме, естественно, 5' → 3'-экзонуклеазной активности), фермент стал даже более термостабилен. Так, если нативная Taq ДНК-полимераза имела время полужизни всего 9 мин при температуре 97,5 °С, то ее Стоффельский фрагмент мог выдерживать уже 21 мин при тех же условиях [Lawyer et al., 1993]. Еще более укороченная Stof delta 12 Taq ДНК-полимераза показала лишь незначительное ухудшение термостабильности, тогда как делеция в 47 аминокислот (288 + 47 = 335) привела к значительной потере как полимеразной активности фермента, так и его термостабильности [Vainshtein et al., 1996]. Другие авторы удалили еще больший фрагмент Taq ДНК-полимеразы размером 413 аминокислотных остатков и при этом получили фермент с заметно ухудшенными свойствами [Villbrandt et al., 1997]. Инактивация 5' → 3'-экзонуклеазной активности Taq ДНК-полимеразы была осуществлена и путем сайтнаправленного мутагенеза отдельных нуклеотидов, приведших к замене некоторых аминокислот в экзонуклеазном домене [Merkens et al., 1995]. Так, мутантные формы R24C и R74H Taq ДНК-полимеразы сохранили лишь незначительную экзонуклеазную активность, но термостабильность фермента и его процессивность превосходят таковые Стоффельского фрагмента Taq ДНК-полимеразы. Фирма "Promega" (США) производит среди прочих термостабильных ДНК-полимераз два варианта Taq ДНК-полимеразы (с молекулярными массами 80 кДа и 85 кДа), выделяемых из природного источника, однако один фермент с меньшей молекулярной массой характеризуется очень низкой 5' → 3'-экзонуклеазной активностью. В данном случае, скорее всего за счет несколько отличающихся условий выделения того и другого фермента, имеет место ограниченный протеолиз, хотя, как подчеркивают авторы, природа этой модификации до конца не ясна [Burke et al., 1992]. В последнее время, кроме модифицированной Taq ДНК-полимеразы, для секвенирования ДНК довольно широко используется и модифицированная Tth ДНК-полимераза, также характеризующаяся отсутствием 5' → 3'-экзонуклеазной активности [Ikeda et al., 1995; Arakawa et al., 1996]. Показано преимущество данного модифицированного фермента над его диким предшественником в реакции циклического секвенирования с меченными биотином дидезоксинуклеотидтрифосфатами.

Однако все эти термостабильные ДНК-полимеразы, характеризующиеся отсутствием экзонуклеазной активности и пригодные для секвенирования как обычным способом, так и в циклической реакции, сохраняли все же один существенный недостаток - высокую избирательность по отношению к включаемым нуклеотидным аналогам и, в частности к дидезоксинуклеотидтрифосфатам. Вследствие этого в реакционную смесь необходимо было вносить весьма высокие концентрации ддНТФ, что, во-первых, было относительно дорого и, во-вторых, заметно увеличивало фон при использовании флуоресцентно меченных ддНТФ. В то же время Т7 ДНК-полимераза, как уже упоминалось выше, значительно менее требовательна к включению нуклеотидных аналогов, но не обладает нужной высокой термостабильностью. Поскольку задача по превращению нетермостабильного белка Т7 ДНК-полимеразы в термостабильный является практически нерешаемой, Табор и Ричардсон задались целью выяснить, что лежит в основе подобной как избирательности, так и неизбирательности разных ферментов по отношению к дидезоксипроизводным [Tabor, Richardson, 1995]. Для этого ими была проведена огромная работа по выявлению сначала участков белковых молекул, а затем и отдельных аминокислот, влияющих на этот процесс. Так, были получены многочисленные гибридные конструкции Т7 ДНК-полимераз с отдельными участками ДНК-полимеразы I E. coli и наоборот. В результате проведенных исследований по ингибированию роста цепи с помощью ддТТФ полученными гибридными конструкциями ДНК-полимераз удалось выявить, что относительно консервативный для многих ДНК-полимераз участок, взаимодействующий с углеводным компонентом нуклеотидов, содержит у Т7 ДНК-полимеразы аминокислоту тирозин, тогда как для ДНК-полимеразы I E. coli и Taq ДНК-полимеразы в этом месте находится близкий тирозину фенилаланин и именно эти аминокислоты ответственны за распознавание углеводного компонента включаемого нуклеотида (рис.).

Предложенная Табором и Ричардсоном гипотетическая схема взаимодействия дНТФ и белка с некоторыми изменениями приведена на рис., из которой видно, что гидроксильные остатки тирозина и дНТФ взаимодействуют с ионом Mg2+ и, таким образом, обеспечивают большее сродство фермента и субстрата. В отсутствие одного или обоих гидроксилов процесс узнавания, видимо, проходит гораздо хуже и, как следствие, имеет место более редкое включение в растущую цепь ДНК дидезоксипроизводных.

Созданные в процессе этой работы измененные ферменты Т7 ДНК-полимеразы (Y526F), ДНК-полимеразы I E. coli (F762Y), Taq ДНК-полимеразы (F667Y) коренным образом изменили свои свойства касательно избирательного включения ддНТФ. (Хотя нумерация здесь приведена для полноразмерных белков, в действительности в работе были использованы ранее клонированные гены: А28 Т7 ДНК-полимераза с делецией 28 аминокислот или секвеназа 2.0 [Tabor, Richardson, 1989b]; Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы IE. coli [Joyce, Gridley, 1983]; Стоффельский фрагмент Taq ДНК-полимеразы с отсутствием 288 аминокислот [Lawyer et al., 1993].

Как можно видеть из табл., секвеназа с присущим ей тирозином демонстрирует в среднем лишь трехкратную дискриминацию при включении дидезоксипроизводных. Для Y526F-секвеназы после произведенной замены тирозина на фенилаланин это соотношение резко возросло и даже превысило таковые для неизмененных Кленовского фрагмента ДНК полимеразы I E. Coli и Стоффельского фрагмента Taq ДНК-полимеразы, изначально характеризующихся низким уровнем включения ддНМФ. В то же время Кленовский фрагмент F762Y и Стоффельский фрагмент F667Y, несущие тирозин вместо фенилаланина, стали включать дидёзоксинуклеотиды более эффективно, чем сама секвеназа.

Наиболее важным результатом этой работы в практическом отношении можно считать создание на основе Стоффельского фрагмента Taq ДНК-полимеразы нового фермента термостабильной ДНК-полимеразы с улучшенными свойствами благодаря высокой эффективности включения в растущую цепь ДНК дидезоксинуклеотидмонофосфатов [Tabor, Richardson, 1995]. Данный фермент получил коммерческое название ТермоСеквеназа и в настоящее время поставляется фирмой "Amersham Pharmacia Biotech" [Reeve, Fuller, 1995; Samols et al., 1995].

Эффективность включения отдельных нуклеотидов и их дидезоксипроизводных различными ДНК-полимеразами

ДНК-полимеразаСоотношение эффективности включения отдельных дезокси- и дидезоксинуклеотидов
dA/ddA dC/ddC gG/ddG dT/ddT dN/ddN
Секвеназа, версия 2.0 3,3 3,7 3,2 2,8 3,0
Секвеназа Y526F 7300 11000 6400 8400 8000
Кленовский фрагмент 720 250 140 1100 600
Кленовский фрагмент F762Y 0,72 0,75 0,56 0,54 0,6
Стоффельский фрагмент 4700 2600 1400 4500 3000
Стоффельский фрагмент F667Y 0,59 0,32 0,45 0,56 0,5

Равномерное включение всех ддНМФ термосеквеназой оказалось наиболее важным для циклического секвенирования ДНК, поскольку использовавшиеся ранее различные варианты Taq- или Tth-полимераз приводили к формированию весьма различающихся пиков флуоресценции при их детекции в автоматическом секвенаторе ДНК, что заметно затрудняло распознавание секвенируемой нуклеотидной последовательности. Впоследствии семейство Taq F667Y термостабильных ДНК-полимераз с улучшенными свойствами несколько увеличилось за счет появления фермента AmpliTaq, FS [Parker et al, 1996] и Taquenase [Voss et al., 1997].

Можно было бы предположить, что создан идеальный фермент для секвенирования ДНК, однако, несмотря на все своим преимущества, термосеквеназа приобрела и важный недостаток, выражающийся в высокой активности пирофосфоролиза. Увеличенная активность пирофосфоролиза термосеквеназы вполне объяснима и даже могла прогнозироваться, поскольку ДНК-полимеразы, являясь ферментами двойного действия, катализируют включение дНМФ/ддНМФ или их отщепление при прочих равных условиях со скоростью, зависящей от своего сродства к субстрату. Так, известно, что Кленовский фрагмент включает в растущую цепь ДНК, например, ддТМФ приблизительно в 1000 раз хуже, чем его природный аналог дТМФ. Но в этом случае и пирофосфоролиз ддТМФ будет таким же весьма редким событием. Поэтому при секвенировании ДНК с использованием Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I E. coli и Стоффельского фрагмента Taq ДНК-полимеразы отрицательный вклад пирофосфоролиза не столь заметен и обычно не принимается во внимание. Однако уже при секвенировании ДНК с помощью секвеназы, характеризующейся лишь трехкратной дискриминацией в отношении дидезоксипроизводных, эффект пирофосфоролиза дает себя знать особенно при продолжительной инкубации реакционной смеси. Для термосеквеназы же, обладающей еще меньшей избирательностью по отношению к ддНТФ, вклад пирофосфоролиза может быть столь заметен, что необходимо прилагать усилия по удалению из реакционной смеси образующегося пирофосфата. Поскольку оптимум температуры для термосеквеназы около 70 °С и она применяется обычно в циклическом секвенировании ДНК со сменой температур, то использование для удаления пирофосфата обычной дрожжевой пирофос-фатазы становится невозможным и тогда для этой цели было предложено использовать термостабильную пирофосфатазу [Reeve, Fuller, 1995; Samols et al., 1995; Vander Horn et al., 1997]. Такой термостабильной пирофосфатазой является фермент, обнаруженный ранее у археба-ктерии Thermoplasma acidophilum и клонированный в Е. coli [Richter, Schafer, 1992a, b].

Завершая рассмотрение различных ДНК-полимераз, находящих применение в секвенировании ДНК, следует отметить, что, несмотря на создание термостабильных ДНК-полимераз с улучшенными свойствами, использование секвеназы, работающей при 37 °С, не потеряло своей актуальности и эти две системы удачно дополняют друг друга [Ranu, 1995].

Ферментативное действие ДНК-полимеразы Ферментативное действие ДНК-полимеразы >>>>



Различные ДНК полимеразы Различные ДНК полимеразы >>>>



Схема полимеразной активности Схема полимеразной активности >>>>



Сайт высокочувствительный к пирофосфоролизу Сайт высокочувствительный к пирофосфоролизу >>>>



Углеврдсвязывающий участок ДНК-полимеразы Углеврдсвязывающий участок ДНК-полимеразы >>>>



Карман связывания ДНК-полимеразы Карман связывания ДНК-полимеразы >>>>


читайте так-же
ДНК чипВ начало
буква "Д"
буквосочетание "ДН"
Добреит

Статья «ДНК-полимераза» была прочитана 16382 раз