Принцип секвенирования днк по сэгнеру

Определение "Принцип секвенирования днк по сэгнеру" в ЭБНБ

Схема секвенирования ДНК "плюс-минус"-методом

Прежде чем перейти к описанию метода секвенирования ДНК, известному ныне как метод Сэнгера, видимо, стоит уделить некоторое внимание более ранним методам секвенирования ДНК, также разработанным Сэнгером и его коллегами. Обычному ныне ферментативному методу секвенирования ДНК с помощью дидезокситерминаторов предшествовал так называемый плюс/минус метод, показанный на рис. 2.1, [Sanger, Coulson, 1975]. В его основе также лежало построение второй радиоактивно меченной (за счет присутствия в реакционной смеси одного меченого наряду с тремя немеченными дНТФ) цепи ДНК по существующей матрице с помощью ДНК-полимеразы I (Кленовского фрагмента). В качестве затравки использовался короткий синтетический олигонуклеотидный десятизвенный праймер. На втором этапе гетерогенные (причем их гетерогенность была крайне желательна, поскольку в противном случае сколь-нибудь значимого результата в секвенировании достичь бы не удалось) продукты удлинения данного праймера отделяли хроматографией на колонке от непрореагировавших ингредиентов и делились на восемь частей. Четыре части были использованы в минус-системе, где в каждой реакции присутствовало по три разных дНТФ, а четвертый отсутствовал. Дальнейшее построение цепи новой порцией Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I приводило к удлинению цепи ДНК в каждой реакции до тех пор, пока в матрице не оказывался нуклеотид, комплементарный отсутствующему. Вторые четыре части с добавлением только одного дНТФ (в каждую - разный) выдерживались в плюс-системе, где в качестве фермента использовалась 3'→5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы фага Т4. Так, последовательное отщепление дНМФ с 3'-конца ДНК шло до тех пор, пока не встречался дНМФ, дНТФ которого присутствовал в реакционной смеси и тогда в действие вступала уже полимеразная активность Т4 ДНК-полимеразы и фрагмент ДНК приобретал свой окончательный размер. По завершению всех этих реакций радиоактивно меченные продукты разделялись в полиакриламидном гель-электрофорезе и экспонировались на рентгеновскую пленку, по которой можно было восстановить нуклеотидную последовательность секвенируемого участка ДНК. Следует отметить, что, несмотря на низкую производительность этого метода, с его помощью была определена почти полная (из 5386 пн) нуклеотидная последовательность фага фХ174 [Sanger et al., 1977b].

Принцип сиквенирования ДНК по Сэгнеру

В еще более ранней работе этих же авторов [Sanger et al., 1973] им удалось с помощью ДНК-полимеразы в присутствии в реакционной смеси ионов Mn²⁺ определить последовательность 50 нуклеотидов фага f1 путем удлинения 8-мерного синтетического праймера и внедрения в растущую цепь ДНК рибонуклеотидов, по которым потом под действием щелочи происходило расщепление цепи. Этот подход лег потом в основу метода секвенирования ДНК частичным рибозамещением [Barnes, 1978]. Эти работы позволили вплотную подойти к разработке метода секвенирования с терминаторами путем синтеза комплементарной цепи ДНК, который и будет рассматриваться в дальнейшем.

В основе метода секвенирования ДНК, разработанного Сэнгером и соавт. [Sanger et al., 1977a], называемого также методом секвенирования путем терминации цепи, лежал принцип ферментативного построения комплементарной цепи ДНК по существующей одноцепочечной матрице при происходящем в разных местах цепи ДНК ингибировании ее дальнейшего роста.

Составляющими этого процесса являлись: одноцепочечная матрица ДНК; короткая затравочная молекула, комплементарная определенному участку матрицы; ДНК-полимераза (Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I E. Coli); 2'-дезоксинуклеотид 5'-трифосфаты (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ или просто дНТФ); 2',3'-дидезоксинуклеотид 5'-трифосфаты (ддАТФ, ддГТФ, ддТТФ, ддЦТФ или просто ддНТФ); реакционный буфер с ионами Mg²⁺.

Ключевым моментом этого процесса являлась терминация построения комплементарной цепи ДНК, происходящая при включении ДНК-полимеразой модифицированных аналогов природных субстратов диде-зоксинуклеотид трифосфатов, являющихся известными ингибиторами ДНК-полимеразы, как было ранее показано в случае с ддТТФ [Atkinson et al., 1969]. Отсутствие второго гидроксильного остатка в 3'-положении рибозного кольца у дидезоксипроизводных приводила к невозможности присоединения к ним следующего нуклеотида, и рост цепи таким образом прерывался. Такое терминирование происходило одновременно как бы в двух режимах - заданном и случайном. Заданность определялась тем, что в одной отдельной пробирке наряду со всеми четырьмя дНТФ (один из которых был радиоактивно меченным) присутствовал только один какой-нибудь конкретный ддНТФ, случайность же происходила от того, что включение данного ддНМФ в растущую цепь ДНК было произвольным, но, естественно, с учетом принципа комплементарности. То есть происходила некая конкуренция между дНТФ и ддНТФ при их выборе ДНК полимеразой. Поскольку в четырех реакционных пробирках (по типу оснований - А, С, G и Т) присутствовало огромное количество молекул секвенируемой ДНК, во много раз превосходящее ту длину фрагмента, которую могла построить ДНК-полимераза, то по теории вероятности каждое положение этого типа оснований во фрагменте ДНК оказывалось представленным соответствующим ддНМФ.

Другим ключевым моментом являлся гетерогенный размер полученных фрагментов ДНК. Их гетерогенность определялась тем, что все З'-концы фрагментов вновь синтезируемой цепи ДНК во всех четырех реакционных пробирках были терминированы соответствующими ддНМФ и, таким образом, представляли собой полный набор всех возможных длин в пределах секвенируемого участка, построенного ДНК-полимеразой. Что касается 5'-конца всех этих фрагментов ДНК, принадлежащих новой цепи, то он должен быть для всех фрагментов строго одинаковым и принадлежать 5'-концу исходной затравочной молекулы.

Продукты реакций терминирования подвергались денатурации и уже одноцепочечные меченые фрагменты, имевшие гомогенный 5'-конец и гетерогенные З'-концы, разделялись по длине высоковольтным электрофорезом высокого разрешения в полиакриламидном геле, позволяющим разделять фрагменты ДНК, отличающиеся всего на один нуклеотид, в четырех соседних дорожках, соответствующих специфическим терминирующим реакциям, например в последовательности Т, С, G, А. По завершению электрофореза гель экспонировался на рентгеновскую пленку и по прошествии некоторого времени (обычно от одних до двух суток) с проявленной пленки можно было "читать" последовательность нуклеотидов секвенируемого участка ДНК, начиная с нижней части геля и последовательно поднимаясь вверх по этим четырем дорожкам, соответствующим одному фрагменту ДНК.

Выше на рис. схематично показан весь описанный выше процесс, но следует отметить, что он несколько идеализирован. При его выполнении экспериментаторов подстерегает множество нюансов, которые могут свести на нет все предварительные усилия. Так, и подготовка самой матрицы к секвенированию, и выбор затравочной молекулы, и определенное соотношение дНТФ/ддНТФ, зависящее, главным образом, от используемой ДНК-полимеразы, и мечение вновь синтезируемой цепи ДНК, и параметры секвенирующего геля, и даже особенности радиоавтографии зависят от конкретных задач и требуют тщательного исполнения.